決明子調(diào)脂作用的代謝組學研究*

鄧楠，余勝，劉文，戴迎春，張惠

（湖南省人民醫(yī)院藥學部，湖南長沙410005）

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決明子調(diào)脂作用的代謝組學研究*

鄧楠，余勝，劉文，戴迎春，張惠

（湖南省人民醫(yī)院藥學部，湖南長沙410005）

摘要：目的運用代謝組學方法考察決明子水提物對高脂血癥大鼠血液內(nèi)源性代謝物的影響。方法建立高脂血癥大鼠模型，采用決明子水提物灌胃治療，利用主成分分析法和偏最小二乘-判別分析對空白對照組、模型組及治療組大鼠血液進行代謝組學分析。觀察3組代謝輪廓差異并尋找生物標志物。結(jié)果利用主成分分析法和偏最小二乘-判別分析能將樣本分開，譜庫分析得到9種生物標志物：L-纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富馬酸、異亮氨酸、絲氨酸、硬脂酸、亞油酸和膽固醇。結(jié)論基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的代謝組學可以很好的從內(nèi)源性代謝物的變化過程反應(yīng)決明子水提物對大鼠的調(diào)脂作用。

關(guān)鍵詞：高脂血癥；決明子；代謝組學；模式識別

高脂血癥是指由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂而使得血漿脂質(zhì)中一種或多種脂質(zhì)的濃度超過正常值的一種病癥。常因危害重要器官或組織而引起嚴重后果，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。⒛X血管意外等，是導致動脈粥樣硬化的獨立危害因素。目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的調(diào)脂藥物包括各種他汀類藥物，如辛伐他汀和洛伐他汀等，他汀類藥物治療高血脂癥的同時可預防心腦血管意外事件[1]。但長期或大劑量使用他汀類藥物可能會導致肝臟組織細胞生物化學變化或心臟橫紋肌溶解等嚴重不良反應(yīng)[2-4]。

因此，研究和開發(fā)安全、有效的新型降血脂藥物具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的一門關(guān)于生物體系內(nèi)源代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學[5]。近年來，代謝組學已被成功的應(yīng)用于高脂血癥的研究，為高脂血癥的診斷和治療提供了有效幫助[6-8]。

決明子作為一種常見的中草藥材，長期臨床應(yīng)用表明，其降脂作用明確，療效可靠，副作用少，但與其他傳統(tǒng)中藥一樣，存在著成分復雜、機制不十分清楚等缺點[9-10]。在前人的基礎(chǔ)上，本研究運用代謝組學方法探討決明子水提物對高脂血癥的逆轉(zhuǎn)程度及調(diào)控作用，闡明決明子調(diào)脂作用的代謝物途徑，為傳統(tǒng)中藥提供藥效學理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Beckman AU5821全自動生化分析儀（美國貝克曼公司），總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白-膽固醇（low-density lipoprotein，LDL-c）、高密度脂蛋白-膽固醇（high-density lipoproteins，HDL-c）測定試劑盒（北京九強生物技術(shù)有限公司提供），WH-2微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司），TGL-16低溫高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），島津GCMS-QP2010氣質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀（日本Shimadzu公司），島津DB-5熔融石英毛細管柱（30 m ×0.25 mm×0.25μm，日本Shimadzu公司）。

膽固醇（北京樂博生物科技有限公司），膽鹽、蛋黃粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司），甲硫氧嘧啶（天津市博迪化工有限公司），決明子（源和堂中藥飲片公司，經(jīng)湖南省人民醫(yī)院藥劑科汪洋主管中藥師鑒定為豆科植物決明Cassia Obtusifolia L.的干燥成熟種子），2-異丙基蘋果酸（美國Sigma公司）。

1.2實驗動物

SD雄性大鼠36只，體重（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2013-0004]。

1.3實驗方法

1.3.1決明子水提液的制備取決明子100 g置于宜煎容器中，加蒸餾水250 ml浸泡0.5 h，加熱煮沸，再小火持續(xù)加熱0.5 h，濾取藥液，殘渣加水250 ml同法煎煮，重復2次，合并3次煎出液，置于50℃水浴鍋中濃縮定容至250 ml，制成生藥含量0.4 g/ml的決明子水提物，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2高脂血癥大鼠模型制備及樣品的采集與制備適應(yīng)環(huán)境3 d后將大鼠隨機分成2組，正常對照組（12只）：普通飼料喂養(yǎng)；高脂血癥模型組（24只）：高脂飼料（蛋黃粉7%、豬油7%、膽固醇4%、膽酸鈉0.4%、丙硫氧嘧啶0.3%及基礎(chǔ)飼料81.3%）喂養(yǎng)。30 d后眼底靜脈叢取血檢測其生化指標，確認造模效果。造模過程中高脂血癥模型組死亡3只，將余下的21只隨機分成2組，分別為模型組（10只）和決明子組（11只）。決明子劑量按60 kg成人常用量的10倍計算，決明子組灌胃決明子水提液2 ml，相當于生藥0.8 g，約2 g/（kg·d），正常組和模型組則給予等量安慰劑（羧甲基纖維素鈉）。治療30 d后眼底靜脈叢取血，離心10 min（4℃，12 000 r/min），取血漿置于-80℃下保存，用于生化指標及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometercomputer，GC-MS）檢測。

1.4生化指標分析

取100μl血漿樣本，利用Beckman AU5821全自動生化分析儀檢測TC、TG、LDL-c及HDL-c。相關(guān)操作步驟參考試劑盒使用說明書。

1.5樣品預處理與GC-MS分析

取血樣室溫解凍，取100μl血漿樣本，加入10μl 2-異丙基蘋果酸/甲醇溶液（內(nèi)標，1 mg/ml），渦旋20 s，加入300μl甲醇沉淀蛋白，渦旋20 s，離心15 min（4℃，12 000 r/min），取上清液置于玻璃離心管，常溫下氮氣吹干，加入50μl甲氧胺吡啶溶液（15 mg/ml），渦旋45 s，70℃水浴肟化1 h，加入100μl硅烷化試劑N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺[bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA，內(nèi)含1% TMCS]，渦旋15 s，70℃水浴1 h，冷卻至室溫，進樣量1μl進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：進樣口溫度280℃，初始柱溫：70℃，保持4 min，以8℃/min速度升溫至300℃，保持3 min；接口溫度：250℃；離子源溫度：200℃；氦氣作為載氣，流速1 ml/min，分流比10∶1，全掃描：35～850 m/z；溶劑切除時間：6.5 min。

1.6統(tǒng)計學方法

生化指標結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，使用島津色譜工作站對GC-MS總離子流圖中各種代謝物的峰面積進行積分，利用NIST107和NIST05數(shù)據(jù)庫對血漿中的代謝物進行鑒定，以相對峰面積（與內(nèi)標峰的比值）表示代謝物的含量，得到GC-MS數(shù)據(jù)。各組灌胃給藥前后的代謝物譜數(shù)據(jù)利用主成分分析法（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA）算法處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1生化指標分析

附表列出了造模前后的比較，正常組造模前后TC、LDL-c變化不明顯（P>0.05），模型組造模前后TC與LDL-c顯著升高（P<0.01），表明造模成功。

2.2GC-MS數(shù)據(jù)分析

大鼠血漿GC-MS總離子流（total ion-current，TIC）圖，構(gòu)成生物代謝物譜，如圖1所示。鑒定結(jié)果，大鼠血漿中有48種內(nèi)源性代謝物。

2.3多元統(tǒng)計分析

2.3.1PCA結(jié)果PCA是一種經(jīng)典的無監(jiān)督代謝組學分析方法，常用于樣本分類的初步分析。運用SIMCA-P 11.0軟件對大鼠血漿中所有的內(nèi)源性代謝物進行PCA分析，結(jié)果如圖2所示。可以看出，正常組和高脂組可以達到分離，決明子組與模型組有分開的趨勢且接近正常組，表明決明子可以改善高脂血癥大鼠狀況。然而樣本分離效果不佳，且PCA對離群點敏感[11]，考慮選用更高要求的化學計量學模式識別方法。

2.3.2PLS-DA結(jié)果PLS-DA是代謝組學中常用的有監(jiān)督的模式識別方法，相對于PCA，PLS-DA以預測均方誤差為回歸目標，使得預測結(jié)果的均方誤差更小，更具可靠性[12]。運用SIMCA-P 11.0軟件對大鼠血漿內(nèi)源性代謝物進行PLS-DA分析，結(jié)果如圖3所示?？梢钥吹秸＝M與模型組在第1、2主成分空間中得到了完全分離，決明子組向正常組靠近，證明橙黃決明素具有較佳的調(diào)脂效果。

附表　大鼠造模前后血脂指標（mmol/L，±s）

附表　大鼠造模前后血脂指標（mmol/L，±s）

組別　TC　TG　HDL-c　LDL-c正常組（n=10）造模前　2.13±0.31 1.88±0.50 0.79±0.16 0.22±0.02造模后模型組（n=21）2.23±0.42　1.52±0.36　0.89±0.12　0.31±0.11造模前　2.09±0.29 2.17±0.68 0.71±0.15 0.20±0.03造模后　4.33±0.65 0.71±0.35 0.98±0.14 1.77±0.31

圖1　大鼠血漿GC-MS總離子流圖

2.3.3生物標志物的確定運用SIMCA-P 11.0軟件進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），得到VIP值圖如圖4所示，從大到小排序所有檢測的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，VIP值越大，說明該數(shù)據(jù)對區(qū)分該模型的貢獻越大，選定為結(jié)構(gòu)鑒定的對象。選取VIP>1.5且有統(tǒng)計學意義的變量（P<0.05）作為生物標志物的判斷標準，根據(jù)它們精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行質(zhì)譜信息匹配，對可能的生物標志物進行鑒定，再輔以標準品進行驗證。結(jié)果得到以下9種生物標志物：L-纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富馬酸、異亮氨酸、絲氨酸、硬脂酸、亞油酸和膽固醇。高脂飼料造模的過程中，大鼠血漿中甘氨酸、絲氨酸、硬脂酸及膽固醇含量上升，丙氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、富馬酸及亞油酸則下降，與已有報道基本符合[7]。決明子治療30 d后，相應(yīng)的變化得到回調(diào)，證明決明子通過調(diào)整體內(nèi)部分氨基酸及游離脂肪酸而起到調(diào)脂作用。

圖2　大鼠血漿樣本的PCA投影圖

圖3　大鼠血漿樣本的PLS-DA投影圖

圖4　大鼠血漿樣本的VIP值

3　討論

決明子作為傳統(tǒng)中藥，其調(diào)脂作用顯著。對比大鼠造模前后內(nèi)源性代謝物的變化，得到潛在的生物標志物包括：L-纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富馬酸、異亮氨酸、絲氨酸、硬脂酸、亞油酸和膽固醇。決明子水提物治療30 d后，大鼠血漿中變化最明顯的9種代謝物分別為：L-纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸、富馬酸、異亮氨酸、絲氨酸、硬脂酸、苯丙氨酸和膽固醇，其中8種代謝物與得到的高脂血癥生物標志物相同，變化均有回調(diào)趨勢。證明了決明子作用于氨基酸及脂肪酸的代謝通路，能夠達到較好的調(diào)脂作用。本研究利用基于GC-MS的代謝組學研究了決明子水提物治療高脂血癥大鼠血漿中代謝物的變化，多元統(tǒng)計分析從代謝物的水平證實了決明子可以較好地調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂，從而達到良好的降脂作用。

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（張蕾編輯）

論著

Metabonomic study on lipid regulative effect of Cassia*

Nan Deng, Sheng Yu, Wen Liu, Ying-chun Dai, Hui Zhang
(Department of Pharmacy, People's Hospital of Hunan, Changsha, Hunan 410005, China)

Abstract:Objective To study the influences of Cassia aqueous extract on endogenous metabolites of blood in rats with hyperlipemia by using metabonomic method. Methods The rats were fed on fat diet to induce hyperlipemia, then treated with cassia aqueous extract. We analyzed metabolic finger print data of rats' plasma in the control, model and treated group. The plasma samples underwent preparation, derivation and GC/MS analysis. Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) was performed to detect the metabolic profile difference between the three groups. Results Through the metabonomic research, 9 biomarkers were found, which were L-valine, alanine, glycine, fumaric acid, isoleucine, leucine, serine, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and cholesterol. Conclusions Metabonomic study based on GC-MS shows a good recognition of the lipid regulating effect of cassia aqueous extract.

Keywords:hyperlipidemia; Cassia; metabonomic; pattern recognition

*基金項目：湖南省科學技術(shù)廳科技計劃項目（No：2014TT2004）

收稿日期：2015-12-20

文章編號：1005-8982（2016）08-0007-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.002

中圖分類號：R-332；R589.2

文獻標識碼：A