小鼠睪丸中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的分析

付　俊，羅艷云，繆時(shí)英，王琳芳

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院　醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

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·論著·

小鼠睪丸中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的分析

付俊，羅艷云，繆時(shí)英，王琳芳

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

摘要：目的探討細(xì)胞連接相關(guān)蛋白在不同發(fā)育階段小鼠睪丸中的表達(dá)模式。方法Western blot檢測(cè)并分析1～6周齡小鼠睪丸、原代支持細(xì)胞以及小鼠精原細(xì)胞系GC1 spg、精母細(xì)胞系GC2 spg、間質(zhì)細(xì)胞系TM3、支持細(xì)胞系TM4等4種生殖相關(guān)細(xì)胞系中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果小鼠睪丸曲細(xì)精管中支持細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin和Claudin，以及支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的階段特異性。而參與細(xì)胞連接的調(diào)節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段以及生殖細(xì)胞系中表達(dá)無(wú)差異。結(jié)論小鼠睪丸曲細(xì)精管中支持細(xì)胞間以及支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)的膜蛋白多表現(xiàn)出明顯的階段特異性。而參與細(xì)胞連接的調(diào)節(jié)蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段中表達(dá)無(wú)差異。

關(guān)鍵詞：血睪屏障；支持細(xì)胞間連接；支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間連接；膜蛋白；調(diào)節(jié)蛋白

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：205-209

在小鼠睪丸曲細(xì)精管中，支持細(xì)胞為包括精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞在內(nèi)的生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)并精細(xì)調(diào)控著各級(jí)生精細(xì)胞的發(fā)育，相鄰的支持細(xì)胞通過(guò)建立血睪屏障形成免疫屏障，將機(jī)體的免疫系統(tǒng)和精子抗原分隔開(kāi)，避免發(fā)生自身免疫性疾病同時(shí)保證精子發(fā)生所需的微環(huán)境。在特定的時(shí)間，支持細(xì)胞間的血睪屏障打開(kāi)，由精原細(xì)胞分化而來(lái)的早期精母細(xì)胞從近基底的小室越過(guò)血睪屏障遷移至近管腔的小室，精母細(xì)胞在靠近管腔的小室發(fā)生減數(shù)分裂并進(jìn)一步發(fā)育為成熟的精子[1]。支持細(xì)胞間建立的血睪屏障由緊密連接和包括基底外質(zhì)特化的錨定連接等多種細(xì)胞連接組成，支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間形成頂部外質(zhì)特化的錨定連接[2]。當(dāng)睪丸先天發(fā)育受損或受到外界環(huán)境刺激，支持細(xì)胞間或者支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間連接的相關(guān)蛋白質(zhì)可能發(fā)生改變。參與支持細(xì)胞間細(xì)胞連接蛋白質(zhì)早已被學(xué)者廣泛研究，比如膜蛋白連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin和Claudin等；支持細(xì)胞和精子細(xì)胞間的細(xì)胞連接分子包括膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E等。膜蛋白鈣黏附蛋白N同時(shí)參與到兩種細(xì)胞連接中。膜內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白緊密連接蛋白(zonula occludens，ZO)- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)與膜蛋白相互作用廣泛的調(diào)節(jié)多種細(xì)胞連接[3]。本研究擬在小鼠睪丸中分析上述多種細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律。

材料和方法

材料C57健康雄性小鼠購(gòu)自維通利華公司。兔抗緊密連接蛋白ZO- 2、CD2相關(guān)蛋白、Afadin、鈣黏附蛋白E和β鏈蛋白抗體購(gòu)自CST公司。兔抗緊密連接蛋白ZO- 1、連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin抗體，膠原酶Ⅰ，透明質(zhì)酸酶購(gòu)自Invitrogen公司。羊抗連接蛋白Nectin- 3抗體和兔抗鈣黏附蛋白N抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。兔抗連接黏附分子C、緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11抗體購(gòu)自Abgent公司。兔抗微管蛋白Tubulin抗體購(gòu)自Bioworld公司。小鼠精原細(xì)胞系GC1 spg、精母細(xì)胞系GC2 spg、間質(zhì)細(xì)胞系TM3、支持細(xì)胞系TM4購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心，由實(shí)驗(yàn)室保存。

小鼠睪丸的分離將小鼠斷頸處死，打開(kāi)腹腔，取下睪丸，用磷酸緩沖液洗1次，迅速放入凍存管并置于液氮。

小鼠睪丸支持細(xì)胞的分離新鮮的3周齡小鼠睪丸，剝?nèi)グ啄び诹姿峋彌_液中洗2遍，膠原酶Ⅰ中消化2次。DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。加入磷酸緩沖液，自然沉降后去上清，重復(fù)2～3遍。沉淀轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿，剪碎組織，加入透明質(zhì)酸酶消化。800×g 離心5 min，去上清，細(xì)胞沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液。換液24 h后低滲處理[4]。

Western blot檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)樣品電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后封入酶標(biāo)二抗孵育1～2 h，洗膜并顯色。

結(jié)果

小鼠睪丸中細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白的表達(dá)在1～6周小鼠睪丸中，支持細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白的表達(dá)模式多有不同(圖1A)。連接黏附分子A在小鼠幼年期睪丸中表達(dá)量較高，2周齡時(shí)達(dá)到峰值。緊密連接蛋白Occludin與連接黏附分子A明顯不同，小鼠幼年期睪丸中基本不表達(dá)，至4周齡睪丸開(kāi)始表達(dá)并逐漸增加。緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11主要在1～2周齡小鼠睪丸中表達(dá)。Claudin 1在1周齡睪丸中最多，而Claudin 11在2周齡時(shí)大量表達(dá)。鈣黏附蛋白N在1～6周齡小鼠睪丸中均有表達(dá)，1周齡時(shí)表達(dá)量略多。支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式也有特異性(圖1A)。連接黏附分子C從2周齡小鼠睪丸中開(kāi)始表達(dá)，并隨周齡逐漸增加。連接蛋白Nectin- 3在幼年期睪丸中基本不表達(dá)，4周齡中開(kāi)始明顯表達(dá)并隨睪丸發(fā)育增加。鈣黏附蛋白E在幼年期小鼠睪丸中表達(dá)較多，3周齡后表達(dá)逐漸減少。

小鼠睪丸中細(xì)胞連接相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)在1～6周齡小鼠睪丸細(xì)胞連接相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白中，緊密連接蛋白ZO- 1和ZO- 2在各周齡表達(dá)比較均等，Afadin在2～4周齡小鼠睪丸中表達(dá)輕微增加，β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白在1～3周齡小鼠睪丸中表達(dá)輕微增加(圖1B)。

小鼠睪丸原代支持細(xì)胞中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)從3周齡小鼠睪丸中分離原代支持細(xì)胞，并用特定的marker SOX9確定。在原代支持細(xì)胞中，檢測(cè)到支持細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)的膜蛋白包括連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 11和鈣黏附蛋白N以及調(diào)節(jié)蛋白包括緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白、CD2相關(guān)蛋白均有表達(dá)，其中連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 11和β鏈蛋白表達(dá)量較大，而膜蛋白包括緊密連接蛋白Occludin和Claudin 1未檢測(cè)到表達(dá)(圖2A、2B)。在原代支持細(xì)胞中，支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)的膜蛋白只有鈣黏附蛋白E表達(dá)，連接黏附分子C和連接蛋白Nectin- 3無(wú)表達(dá)(圖2A、2B)。

JAM：連接黏附分子；ZO：緊密連接蛋白；CD2AP：CD2相關(guān)蛋白；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；1～6：1～6周小鼠睪丸JAM：junctional adhesion molecule；ZO：zonula occludens；CD2AP：CD2-associated protein；Mr：relative molecular mass；1- 6：1- 6-week mouse testes

A.細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白的表達(dá)；B. 細(xì)胞連接相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)

A. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

圖 11～6周小鼠睪丸中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

Fig 1Expressions of proteins associated with cell junctions in 1- 6-week mouse testes

小鼠生殖細(xì)胞系中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)在小鼠生殖細(xì)胞系GC1、GC2、TM3和TM4中，膜蛋白包括鈣黏附蛋白N以及調(diào)節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白在4種細(xì)胞系中均有表達(dá)，連接黏附分子A在GC1細(xì)胞系中有表達(dá)，支持細(xì)胞間膜蛋白包括緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1和Claudin 11在4種細(xì)胞系中無(wú)表達(dá)(圖2C、2D)。支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)的膜蛋白連接黏附分子C、連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E在4種細(xì)胞系中無(wú)表達(dá) (圖2C、2D)。

討論

小鼠出生后，睪丸需進(jìn)一步發(fā)育并成熟，16 d時(shí)小鼠睪丸支持細(xì)胞間出現(xiàn)與血睪屏障有關(guān)的細(xì)胞連接復(fù)合物，至20 d左右支持細(xì)胞間血睪屏障形成[3]，血睪屏障成熟后睪丸中生精細(xì)胞才能發(fā)生減數(shù)分裂，大量的生精細(xì)胞不斷增加使睪丸中支持細(xì)胞的比例隨睪丸發(fā)育而降低，因此3周齡是分離原代支持細(xì)胞的最佳周齡。有研究顯示小鼠1周齡睪丸中支持細(xì)胞比例占到3/4，2周齡時(shí)下降至37%，3周齡下降至28%，成年后僅有3%[5]。因此，在不同發(fā)育階段的小鼠睪丸樣品中，部分細(xì)胞連接相關(guān)蛋白可能因睪丸發(fā)育中支持細(xì)胞的比例降低而相對(duì)減少。本研究主要探討參與支持細(xì)胞間細(xì)胞連接的膜蛋白包括連接黏附分子A、緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1、Claudin 11和鈣黏附分子N，參與支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接的膜蛋白包括連接黏附分子C，連接蛋白Nectin- 3和鈣黏附蛋白E，膜內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白包括緊密連接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。

緊密連接蛋白Occludin是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)存在于緊密連接處的膜蛋白，有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，臨近細(xì)胞的細(xì)胞連接處，兩個(gè)細(xì)胞的Occludin的胞外環(huán)區(qū)相互結(jié)合形成復(fù)合物[6]。Occludin敲除小鼠不育，但幼年期睪丸未發(fā)現(xiàn)異常[7]。雖然4周齡后小鼠睪丸中支持細(xì)胞的比例不斷降低，但本研究顯示Occludin主要在4周齡以后的小鼠睪丸中表達(dá)，表明其主要發(fā)揮作用于成熟后的支持細(xì)胞的細(xì)胞連接中，這與Occludin敲除小鼠幼年期睪丸發(fā)育正常呼應(yīng)。

Tes- 3：3周齡睪丸；Tes- 5：5周齡睪丸；SC：原代支持細(xì)胞；GC1：精原細(xì)胞系GC1 spg；GC2：精母細(xì)胞系GC2 spd；TM3：間質(zhì)細(xì)胞系；TM4：支持細(xì)胞系

Tes- 3：3-week testes；Tes- 5：5-week testes；SC：primary sertoli cells；GC1：spermatogonia cell line GC1 spg；GC2：spermatocyte cell line GC2 spg；TM3：leydig cell line；TM4：sertoli cell line

A、C.細(xì)胞連接相關(guān)膜蛋白的表達(dá)；B、D.細(xì)胞連接相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)

A，C. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B，D. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

圖 2原代小鼠睪丸支持細(xì)胞和生殖相關(guān)細(xì)胞系中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

Fig 2Expressions of proteins associated with cell junctions in primary sertoli cells and in reproductive related cell lines

膜蛋白連接黏附分子JAM胞外區(qū)含有兩個(gè)免疫球蛋白樣的環(huán)，定位于上皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接處[8]。緊密連接蛋白Claudin有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其表達(dá)和定位受包括激素和炎癥因子等很多因素的調(diào)節(jié)[6]。Claudin 11敲除小鼠睪丸支持細(xì)胞間的緊密連接消失并且小鼠不育[6]。在血睪屏障處，連接黏附分子A或者Claudin均與調(diào)節(jié)蛋白緊密連接蛋白ZO- 1和ZO- 2相互作用并被后兩者調(diào)節(jié)[3]。本研究顯示連接黏附分子A、緊密連接蛋白Claudin 1和Claudin 11在幼年期睪丸即血睪屏障建立早期表達(dá)量較高，提示三者在血睪屏障的建立中發(fā)揮重要功能。在原代分離的支持細(xì)胞中，連接黏附分子A和Claudin 11的表達(dá)量顯著高于小鼠睪丸，可能因二者高表達(dá)于睪丸支持細(xì)胞中，在支持細(xì)胞被分離純化后，連接黏附分子A和緊密連接蛋白Claudin 11兩個(gè)蛋白也相對(duì)被富集。

鈣黏附蛋白N主要定位于支持細(xì)胞間的細(xì)胞連接處，在一些特定時(shí)期還定位于支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間的細(xì)胞連接處，而鈣黏附蛋白E大量定位于生精細(xì)胞中[7]。鈣黏附蛋白-鏈蛋白復(fù)合物對(duì)于鈣黏附蛋白Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附是必需的。在睪丸中，鏈蛋白定位于支持細(xì)胞間的血睪屏障處以及支持細(xì)胞與精原細(xì)胞或者精母細(xì)胞的細(xì)胞連接處[6]。CD2相關(guān)蛋白在睪丸曲細(xì)精管支持細(xì)胞間的細(xì)胞連接處與鈣黏附蛋白N、β鏈蛋白和緊密連接蛋白ZO- 1等相互作用。CD2相關(guān)蛋白敲除小鼠血睪屏障被破壞，并導(dǎo)致精子發(fā)生障礙[9]。β鏈蛋白和CD2相關(guān)蛋白在1～3周齡小鼠睪丸中表達(dá)量相對(duì)于后期略高，可能因睪丸發(fā)育過(guò)程中支持細(xì)胞的比例逐漸降低有關(guān)。

連接黏附分子C表達(dá)于發(fā)育中的圓形和長(zhǎng)形精子中，定位于支持細(xì)胞-精子細(xì)胞的細(xì)胞連接處。在連接黏附分子C敲除小鼠中，成熟的精子細(xì)胞消失，表明其在精子發(fā)生中有必要的功能[8，10]。與連接黏附分子C類(lèi)似，連接蛋白Nectin- 3表達(dá)于長(zhǎng)形精子中，定位于支持細(xì)胞- 生精細(xì)胞的細(xì)胞連接處[7]。Nectin- 3敲除小鼠中精子細(xì)胞的極性缺失[8]。Afadin與Nectin在胞內(nèi)形成復(fù)合物，并調(diào)節(jié)其功能。在支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接中Afadin與Nectin- 3相互作用[11]。本研究顯示隨著睪丸發(fā)育，連接黏附分子C和Nectin- 3依次開(kāi)始表達(dá)。連接黏附分子C和Nectin- 3主要由支持細(xì)胞-精子細(xì)胞連接處的生精細(xì)胞表達(dá)，因此在分離的原代睪丸支持細(xì)胞中未檢測(cè)到表達(dá)。

本研究顯示參與細(xì)胞連接的調(diào)節(jié)蛋白在睪丸的不同發(fā)育階段以及生殖細(xì)胞系中表達(dá)基本均衡。而不論是支持細(xì)胞間還是支持細(xì)胞-生精細(xì)胞間細(xì)胞連接相關(guān)的膜蛋白多表現(xiàn)出明顯的階段特異性，并且這些膜蛋白在生殖細(xì)胞系中基本不表達(dá)，提示這些膜蛋白的表達(dá)受到精細(xì)的調(diào)控，同時(shí)需要睪丸微環(huán)境的調(diào)節(jié)。細(xì)胞連接相關(guān)蛋白多與器官發(fā)育和生育力密切相關(guān)[12]，本研究結(jié)果為深入了解精子發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞連接相關(guān)蛋白的作用提供了重要信息。

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Expression Patterns of the Proteins Associated with Cell Junctions in Mouse Testes

FU Jun，LUO Yan-yun，MIAO Shi-ying，WANG Lin-fang

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100005，China Corresponding author：WANG Lin-fangTel：010- 69156418，E-mail：wang.linfang@imicams.ac.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo study on the expression patterns of proteins associated with cell junctions in the developing mouse testes. MethodThe expression levels of reproductive related cell lines spermatogonia cell line GC1 spg，spermatocyte cell line GC2 spg，leydig cell line TM3，and sertoli cell line TM4, primary sertoli cells,and 1- 6-week mouse testes were analyzed using Western blot. ResultsThe sertoli cell junction-associated membrane proteins adhesion molecule A，Occludin and Claudin，and the sertoli-germ cell junction-associated membrane proteins junctional adhesion molecule C，Nectin- 3，and E-cadherin were stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. The adaptor proteins associated with cell juctions zonula occludens- 1，zonula occludens- 2，Afadin，β-catenin，and CD2-associated protein were not stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. ConclusionsIn the seminiferous tubules in the mouse testes，the membrane proteins associated with cell junctions are stage-specific. However，the expressions of adaptor proteins associated with cell junctions do not obviously change.

Key words：blood-testis barrier；sertoli cell junctions；sertoli-germ cell junctions；membrane proteins；adaptor proteins

(收稿日期：2015- 09- 15)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.014

中圖分類(lèi)號(hào):Q249

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)02- 0205- 05

通信作者：王琳芳電話：010- 69156418，電子郵件：wang.linfang@imicams.ac.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31401273)和國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2012CB944902)Supported by Grand for the Youth from National Natural Science Foundation of China(31401273)and the National Important Research Plan of China(2012CB944902)