MTHFR基因多態(tài)性與蒙古族絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究

郭志英，栗平，羅云娜，張淑珍，武志鋒

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院功能科，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010030)

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MTHFR基因多態(tài)性與蒙古族絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究

郭志英，栗平，羅云娜，張淑珍，武志鋒

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院功能科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010030)

摘要：目的探討本地區(qū)蒙古族絕經(jīng)后婦女亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因的多態(tài)性位點(diǎn)C677T、A1298C基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)遺傳易感性的關(guān)系。方法收集150 例門診及住院(確診為骨質(zhì)疏松)蒙古族絕經(jīng)后婦女為觀察組，對(duì)照組來(lái)自門診按年齡配比的骨含量正常的蒙古族絕經(jīng)后婦女145 例，均以雙能X線骨密度儀測(cè)定腰椎和髖部骨密度，以T值≤-2.5診斷為骨質(zhì)疏松，-2.5≤T≤-1.0為骨含量減少，T值>-1.0為骨含量正常，并進(jìn)行MTHFR C677T及A1298C基因多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果骨質(zhì)疏松組MTHFR基因受體C677T基因型CC、CT、TT頻率分別為29.3%、44.0%和27.7%，對(duì)照組基因型CC、CT、TT頻率分別為42.8%、44.8%和12.4%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。骨質(zhì)疏松癥組中的T等位基因頻率為48.7%，顯著高于對(duì)照組(34.8%，P=0.005)，提示T等位基因是骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。與CC基因型相比，TT基因型攜帶者的骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)，該作用在年齡≥60 歲及體重指數(shù)偏高的女性中表現(xiàn)更明顯。而MTHFR A1298C的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生沒有顯著影響(P=0.513)。結(jié)論MTHFR C677T基因變異與蒙古族絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松易感性明顯相關(guān)，MTHFR A1298C的多態(tài)性位點(diǎn)與蒙古族絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松癥；亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；絕經(jīng)后婦女

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是老年女性人群中常見的一種代謝性骨病，其特點(diǎn)為高轉(zhuǎn)換型骨量丟失、骨吸收大于骨形成而易致骨折發(fā)生。一旦發(fā)生骨折，將會(huì)影響老年女性的生存質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)可致殘甚至致死。因此，有關(guān)PMOP的防治研究具有非常重要的臨床價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。PMOP作為遺傳與環(huán)境因素共同作用的一類復(fù)雜性疾病受諸多因素的影響，而基因所起的作用占70%左右[1]，如維生素D受體基因、雌激素受體基因、Ⅰ型膠原蛋白等[2-4]。新近報(bào)道的白介素-6(interleukin-6，IL-6)在日本女性人群中也與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[5]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)基因是影響骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病的重要候選基因之一，它是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。本研究擬采用以婦女為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究方法，探討MTHFR基因的功能性SNPs位點(diǎn)(C677T和A1298C)與我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松易感性的關(guān)系，進(jìn)一步闡明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的可能分子機(jī)制，為骨質(zhì)疏松癥的防治提供理論基礎(chǔ)和新的線索。

1資料與方法

1.1對(duì)象入選病例要求為55～75 歲門診及住院骨質(zhì)疏松女性患者，蒙古族聚居區(qū)三代純蒙古族，年齡方面保持均衡，具有可比性。排除有影響骨代謝的疾病及其他需長(zhǎng)期治療的嚴(yán)重慢性疾病者，共有150 例患者作為觀察組納入調(diào)查。對(duì)照組為來(lái)自門診體檢的同條件女性蒙古族人群，均由專業(yè)人員采用雙能X線骨密度儀對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行腰椎及雙側(cè)股骨近端股骨頸骨密度測(cè)定，以T值≤-2.5診斷為骨質(zhì)疏松，-2.5≤T≤-1.0為骨含量減少，T值>-1.0為骨含量正常。

1.2方法每個(gè)樣本對(duì)象抽取5 mL靜脈血，分裝于EDTA抗凝管中，用于提取基因組DNA，收集好的抗凝血貯存于-80℃冰箱備用。本研究的標(biāo)本收集均經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可并獲得患者知情同意。采用OMEGA D3392全血DNA小量提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)提取DNA，按常規(guī)蛋白酶K、酚/氯仿法提取，然后由聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)檢測(cè)295 例樣本C677T、A1298C基因型分布情況。C677T引物序列如下：上游引物：5′GGGGTCAGAAGCATATCAGT-3′；下游引物：5′-CTCACCTGGATGGGAAAGA-3′。A1298C引物序列如下：上游引物：5′GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3′；下游引物：5′-TCTCCCGAGAGGTAAAGAACAAA-3′。擴(kuò)增參數(shù)：50℃預(yù)熱2 min，95℃預(yù)變性10 min，然后95℃變性15 s，62℃復(fù)性1 min，共40個(gè)循環(huán)，400V恒溫電壓、2%瓊脂糖膠電泳，電泳15 min后取膠。擴(kuò)增后用紫外線凝膠圖像分析系統(tǒng)分析并保存，最后在熒光定量PCR儀(7700型，ABI公司)上檢測(cè)熒光信號(hào)。

酶切反應(yīng)總體積15 μL，包括10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 μL TapⅠ(1U)內(nèi)切酶，2 μL的10×Buffer TapⅠ，2 μL的H2O。65℃水浴過夜，400 V恒溫電壓、2%瓊脂糖膠電泳，電泳15 min后取膠，應(yīng)用凝膠成像儀判斷酶切結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)Hardy-Weinberg定律，比較各組基因型和等位基因頻率的實(shí)際數(shù)與預(yù)期數(shù)，了解各基因型在人群中遺傳平衡符合程度。兩組之間的基因和等位基因頻率差異進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，并計(jì)算比值比。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)對(duì)照組145 例中，兩種基因型在對(duì)照組中的分布規(guī)律均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(見表1～2)。

表1　Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表2　研究對(duì)象基本資料±s)

2.2骨質(zhì)疏松組和對(duì)照組MTHFR中兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型比較對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率：CC 42.8%、CT44.8%和TT 12.4%，而骨質(zhì)疏松組的基因型頻率：CC9.3%、CT 44.0%和TT 27.7%。骨質(zhì)疏松組和對(duì)照組CC、CT、TT種基因型分布頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.155，P=0.017)。骨質(zhì)疏松組中C、T等位基因頻率為51.3%、48.7%，對(duì)照組為65.2%、34.8%，骨質(zhì)疏松組和對(duì)照組的C、T等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.920，P=0.005)。T的骨質(zhì)疏松發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是C的1.77倍(95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。與CC純合子比較，TT純合子的骨折風(fēng)險(xiǎn)增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)。

MTHFR A1298C的3種基因型頻率在骨質(zhì)疏松組中分別為：AA 62.7%、AC 20.0%和CC 17.3%，而對(duì)照組基因型分布為AA 66.2%、CC 22.1%和CC 11.7%。A1298C基因型多態(tài)性位點(diǎn)和骨質(zhì)疏松易感性無(wú)明顯相關(guān)(χ2=1.335，P=0.513)。詳細(xì)資料見表3。

表3　病例組和對(duì)照組中MTHFR兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型比較

3討論

骨質(zhì)疏松是一種普通的代謝性骨病，是眾所周知的“沉默病”，往往沒有癥狀，直到髖部受到輕微創(chuàng)傷發(fā)生骨折才被人們所關(guān)注，該病已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一[11]。其特征為骨量下降、骨骼脆性增加和骨組織微觀結(jié)構(gòu)破壞，最終引起骨折發(fā)生率增加。骨質(zhì)疏松性骨折是老年人群殘疾和間接死亡的最主要原因，嚴(yán)重影響老年人晚年生活質(zhì)量。本研究旨在研究MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)C677T、A1298C基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥遺傳易感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)C677T基因變異與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥易感性明顯相關(guān)。如果能從基因方向找到老年骨質(zhì)疏松癥的根本性原因，將對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療產(chǎn)生積極影響。

近年來(lái)遺傳因素對(duì)骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率的影響逐步受到重視。亞甲基四氫葉酸還原酶基因是影響骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病的重要候選基因之一，它是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。MTHFR是一種黃素依賴蛋白，定位于染色體lp36.3，作為同型半胱氨酸代謝再甲基化途徑中的關(guān)鍵酶，同型半胱氨酸是含硫醇的氨基酸，形成于蛋氨酸代謝中。MTHFR普遍存在于人、動(dòng)物及其他原核、真核生物體內(nèi)，哺乳類動(dòng)物以肝臟分布最多，能將5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-亞甲基四氫葉酸，為同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼釁⒓哟x提供甲基，此環(huán)節(jié)受阻可導(dǎo)致同型半胱氨酸在體內(nèi)蓄積。有研究還發(fā)現(xiàn)，MTHFR的基因C677T純合子突變型TT基因型患者血中同型半胱氨酸濃度高于野生型基因型(CC型)。近年來(lái)澳大利亞的Wong等[7]對(duì)老年人半胱氨酸水平的研究支持這一結(jié)果。而CT基因型血同型半胱氨酸濃度介于兩者之間，從而引起一系列病理生理過程[8-9]，繼而與多種疾病的發(fā)生(如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、腦卒中、冠心病及神經(jīng)管畸形等等)產(chǎn)生一定關(guān)聯(lián)[10-13]。有一些研究報(bào)道認(rèn)為，該基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折或低BMD風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。然而，也有研究未能確證這種關(guān)聯(lián)。例如，近來(lái)在墨西哥人群的基因檢測(cè)證實(shí)了MTHFR C677T與骨質(zhì)疏松的遺傳易感性[14]。相反，Golbahar等發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與伊朗女性股骨頸或腰椎BMD沒有關(guān)聯(lián)。我國(guó)香港人群的研究結(jié)果也顯示，MTHFR C677T與骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)[15]。這些研究結(jié)果的差異可能部分由于研究人群的不同，如種族、年齡、環(huán)境和遺傳修飾。

本研究從分子流行病學(xué)角度探討了MTHFR基因的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(A677T和A1298C)與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。而在以上相關(guān)研究中，A1298C多態(tài)性位點(diǎn)與疾病的關(guān)系并不密切。近年來(lái)對(duì)于MTHFR的研究日益廣泛，我國(guó)僅有該基因與江蘇地區(qū)絕經(jīng)后女性的相關(guān)性報(bào)道，其他地區(qū)鮮見。本次研究的主要目的在于找出該基因與老年人骨質(zhì)疏松的關(guān)系，以期達(dá)到及早預(yù)防和治療的目的，最大幅度降低老年人晚年因骨質(zhì)疏松乃至骨折帶來(lái)的對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)的重大負(fù)擔(dān)。

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Association of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) Polymorphism with Osteoporosis in Mongolian Postmenopausal Women

Guo Zhiying，Li Ping，Luo Yunna，etal

(The Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010030，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)gene C677T、A1298C polymorphisms and osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.MethodsOne hundred and fifty postmenopausal female patients with osteoporosiswere enrolled.one hundred and forty-five contrasts were healthy Mongolian postmenopausal women outpatients matched with age to conduct a case-control study.Bone mineral density (BMD) at lumbar spine，femoral neck，trochanter and Ward′s triangle were measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).The T value is less than or equal to -2.5 for the diagnosis of osteoporosis；-2.5≤T≤-1.0 for bone decreased；the T≥-1.0 content of normal bone.and MTHFR gene polymorphism measurement were performed to all subjects.ResultsThe frequencies of MTHFR C677T Genotype CC、CT and TT in osteoprosis group were 29.3%，44.0% and 27.7%，respectively，in the contrasts group.The frequencies of MTHFR were 42.8%、44.8% and 12.4%.the difference between groups was statistically significant (P=0.017).The frequencies of T allelic genes was 48.7% in osteoporosis group，evidently higer than that in contrast group (34.8%，P=0.005).T was the risk factor of osteoporosis (OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001).Comparing to the CC，TT genotype carriers loose osteoporosis risk increases to 3.15 times (95% CI=1.45～6.86，P=0.004).On the otherside，Polymorphism of MTHFR A 1298C on the occurrence of postmenopausal osteoporosis had no significant effect (P=0.513).The effect was more obvious in 60 years of age or elder and high BMI in women.ConclusionThe MTHFR C677T polymorphism may contribute to the susceptibility of osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.

Key words：osteoporosis；methylene tetrahydrofolate reductase；genic polymorphism；postmenopausal women

作者簡(jiǎn)介：郭志英(1979- )，女，主治醫(yī)師，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院功能科，010030。

收稿日期：2015-08-25

中圖分類號(hào)：R322.7+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院院級(jí)科研項(xiàng)目(2013YJJ29)