液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留

馬 駿，羅華明，張玲茜

(1.臺州市海洋環(huán)境監(jiān)測中心,浙江臺州318000; 2.臺州市水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心,浙江臺州318000)

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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留

馬 駿1，2，羅華明2，張玲茜1

(1.臺州市海洋環(huán)境監(jiān)測中心,浙江臺州318000; 2.臺州市水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心,浙江臺州318000)

摘 要：建立起一種用于測定水產(chǎn)品中呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮等代謝物殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取,以二甲亞礬為衍生試劑,利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行分析測定。以乙腈和0.2%乙酸水溶液作為流動相,梯度洗脫,電噴霧正離子多反應(yīng)模式監(jiān)測。在0.5～10.0 μg·kg-1時,4種硝基呋喃類代謝物呈良好的線性關(guān)系,且回歸系數(shù)都在0.999以上,回收率為89.05%～95.51%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.09%～5.05%。該方法靈敏、準(zhǔn)確、高效,適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留的測定。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃代謝物;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;儀器分析

文獻著錄格式:馬駿,羅華明,張玲茜.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,57 (4):558-562,610.

硝基呋喃類藥物(nitrofurans)是人工合成的一類具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物,主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮。呋喃唑酮具有廣譜抗菌活性,有單胺氧化酶抑制作用,可抑制苯丙胺等藥物的代謝而導(dǎo)致血壓升高,另外也可抑制乙醛脫氫酶的活性[1];呋喃妥因主要用于治療尿道感染,對大多數(shù)革蘭氏陽性和陰性菌,如大腸桿菌、腐生鏈球菌、腸球菌及變形桿菌,有殺滅或抑制作用,在尿道中具有較強的抗菌作用[2];呋喃西林主要供局部應(yīng)用或創(chuàng)傷感染時外用消毒。

呋喃它酮具有強致癌性,呋喃唑酮具中等強度致癌性。1976年,美國食品和藥物管理局(FDA)指出:呋喃唑酮在動物體內(nèi)降解非常迅速,可能具有致癌性[3]。Ali[4]通過對小白鼠和大白鼠的毒性研究表明,呋喃唑酮可以誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌,并且存在劑量反應(yīng)關(guān)系;高劑量飼喂食用魚和觀賞魚,可誘導(dǎo)魚的肝臟發(fā)生腫瘤[5];且能影響細(xì)胞的染色體交換和對損傷的修復(fù),可使DNA單鏈發(fā)生內(nèi)部交鏈從而抑制DNA的合成,并且能夠抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成[6]。

呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)物分別為3-氨基-2-唑烷基酮(簡稱AOZ,下同)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(簡稱AMOZ,下同)、氨基脲(簡稱SEM,下同)、1-氨基-2-內(nèi)酰脲(簡稱AHD,下同)。呋喃唑酮進入體內(nèi)后,代謝非常迅速。魚體內(nèi)的半衰期僅0.27 h[7]。由于硝基呋喃類代謝物殘留具有較低的質(zhì)量和微弱的紫外吸收特性,致使分析檢測變得困難。為了誘導(dǎo)分子紫外吸收,通常將代謝物用2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)衍生,以使其代謝物能被液相色譜紫外檢測器檢測到。硝基呋喃代謝產(chǎn)物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)可在酸性條件下被水解,可同時用2-NBA衍生化。目前,對其代謝物殘留進行檢測主要有液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法。本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度,對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量及其不確定度評定進行探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器

API300串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國ABI公司),配有電噴霧離子源(ESI源)和Agilent 1100 series高效液相色譜儀; Heraeus Biofuge Stratos臺式離心機; WH-866旋渦混合器; pH計;恒溫水浴振蕩器;電子天平;勻漿機;超純水器; OA-SYSTM氮吹儀; ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm× 150 mm×5 μm);

1.1.2試劑

標(biāo)準(zhǔn)品有呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD,均由德國Dr.E公司提供。

衍生化試劑。稱取200 mg 2-NBA (Sigma公司,德國)溶于12.5 mL二甲亞礬中,現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜級。

定容液。0.2%乙酸∶乙腈15∶85 (V/V),鹽酸溶液(0.2 mol·L-1),氫氧化鈉溶液(0.1,1 mol·L-1)。

1.1.3對蝦

對蝦樣品均由臺州市水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心提供。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.5 mg·mL-1)配制。精密稱取硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品AOZ,AMOZ,SEM,AHD,用甲醇定容,4℃以下保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇∶水按1∶1的體積比稀釋至相應(yīng)濃度,4℃以下保存。

1.2.2樣品及標(biāo)準(zhǔn)品處理

參照GB/T 21311—2007進行操作。稱取2 g(精確至0.01 g)勻漿后的樣品于50 mL離心管中,加入0.2 mol·L-1鹽酸溶液20 mL和衍生化試劑1.0 mL,漩渦振蕩2 min,之后置于恒溫水浴振蕩器上37℃避光振蕩水解過夜(約16 h)。取出冷卻后,加入0.5 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液1 mL,然后用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～ 7.5。加入乙酸乙酯10 mL,振搖1 min,4 000 r· min-1離心10 min,收集乙酸乙酯層,再用乙酸乙酯10 mL重復(fù)提取1次,合并乙酸乙酯層,50℃氮氣吹干,殘留物用1 mL含0.2%乙酸的15%乙腈水溶液超聲溶解,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,取40 μL進樣檢測。

1.3HPLC-MS/MS檢測

1.3.1HPLC條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm×5 μm);柱溫為35℃;梯度洗脫程序見表1。

表1　流動相梯度洗脫程序

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS)為5 500 V;霧化氣(NEB)參數(shù)為10;氣簾氣( CUR )參數(shù)為11;碰撞氣(CAD)參數(shù)為6;輔助氣(AUX)流速為8 L· min-1;輔助氣溫度(TEM)為475℃;去簇電壓(DP)為50 V;聚焦電壓(FP)為350 V;碰撞室出口電壓(CXP)為13.0 V; Q1,Q3均為單位分辨率(UNIT)。定性離子對、定量離子對、采集時間(Dwell)及碰撞能量(CE)具體見表2。

表2　硝基呋喃類代謝物檢測的部分質(zhì)譜參數(shù)

2　結(jié)果與分析

2.1測定方法的線性關(guān)系

采用內(nèi)標(biāo)法對定量離子對進行定量計算,以待測物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo),以待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),建立線性關(guān)系(圖1)。

在待測物濃度0.5～10.0 μg·kg-1的范圍內(nèi),4種硝基呋喃類代謝物均呈良好的線性關(guān)系,回歸系數(shù)都在0.999以上。

圖1　硝基呋喃類代謝物的線性關(guān)系

2.2樣品測定

按照上述方法和條件對樣品進行檢測,得出的質(zhì)譜圖見圖2。

2.3系統(tǒng)精密度

用所建立的檢測方法測定加標(biāo)的同一對蝦樣品,測定結(jié)果見表3。

表3　系統(tǒng)精密度測定結(jié)果

2.4回收率

以對蝦空白樣品為試驗材料,并向空白樣品中分別添加濃度為0.5,1.0和5.0 μg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)品,然后按照上述方法進行水解衍生,提取凈化后用于測定,以內(nèi)標(biāo)法計算來驗證方法的回收率。結(jié)果見表4。

2.5質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)硝基呋喃類藥物分子的結(jié)構(gòu)特征,選擇ESI ( + )作為電離模式,采用半自動進樣方式,分別用高濃度(1.0 mg·mL-1)的AMOZ,SEM,AHD和AOZ及同位素內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的標(biāo)準(zhǔn)溶液在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化,然后調(diào)節(jié)pH值至近7.4,再用乙酸乙酯萃取2次,氮氣吹干,然后用甲醇/水溶液(1∶1,V/V)溶解殘留物。接著以流動注射的方式在正離子模式下對4種代謝物和4種內(nèi)標(biāo)物的衍生化產(chǎn)物進行母離子全掃描,確定AMOZ,SEM,AHD,AOZ,AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-D3和SCA-13C-15N2的m +1離子分別為m/z 335,m/z 209,m/z 249,m/z 236,m/z 240,m/z 340,m/z 252和m/z 212。然后分別以所得的m/z數(shù)為母離子,對其子離子進行全掃描,結(jié)果如圖3所示,并從中選取2個子離子。之后,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)優(yōu)化去簇電壓(DP)、聚焦電壓(FP)、碰撞氣(CAD)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù),結(jié)果顯示,以DP和CE對離子對的豐度影響最大(圖4)。

圖2　硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)物的提取離子色譜圖

表4　回收率測定結(jié)果

接著用FIA方式繼續(xù)優(yōu)化霧化氣(NEB)、氣簾氣(CUR)、電噴霧電壓(IS)、輔助氣溫度(TEM)等參數(shù)。

圖3　子離子的掃描結(jié)果

圖4　不同質(zhì)譜條件對離子對豐度的影響

3　小結(jié)

本文基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的測定方法進行研究,建立起一套基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜可同時測定水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物(AOZ,AMOZ,SEM,AHD)的方法。該方法在0.5～10.0 μg· kg-1線性良好。用內(nèi)標(biāo)法定量,樣品回收率在80%～110%,符合出口日本、歐盟等國家的最低殘留檢測限量要求(1 μg·kg-1)。

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(責(zé)任編輯：高 峻)

中圖分類號：S668.4

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0528-9017(2016)04-0558-05

DOI10.16178/j.issn.0528-9017.20160433

收稿日期:2015-12-31

作者簡介:馬 駿(1982—),男,浙江臨海人,本科,工程師,主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量與海洋環(huán)境監(jiān)測研究工作,E-mail:tzhyjmajun009@163.com。