酶解條斑紫菜制備抗氧化肽及綜合利用

劉冬冬，　田亞平（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

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酶解條斑紫菜制備抗氧化肽及綜合利用

劉冬冬，田亞平*
（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

摘要：將酶解反應(yīng)與幾種膜分離技術(shù)集成構(gòu)建一種制備紫菜抗氧化肽，并同時分級分離其它活性物質(zhì)以實現(xiàn)綜合利用。先后采用截留相對分子質(zhì)量10 000的超濾膜和500的納濾膜對紫菜酶解液進行分離純化，優(yōu)化操作參數(shù)，抗氧化肽回收率達73.1%，多糖回收率達55%，膳食纖維回收率達85%，多肽得率達18%；考察該工藝所得紫菜抗氧化多肽的應(yīng)用特性，結(jié)果表明：納濾濃縮后多肽液0.5 mg/mL對DPPH自由基清除率可達68.5%，該多肽最適作用pH為8.5，經(jīng)80℃處理6 h后的紫菜抗氧化肽仍保留83%左右的相對DPPH自由基清除率。

關(guān)鍵詞：紫菜；抗氧化肽；膜分離技術(shù)；綜合利用

多肽是一類由氨基酸構(gòu)成且有蛋白質(zhì)特性但又不同于蛋白質(zhì)的中間物質(zhì)。具有調(diào)節(jié)機體生理功能和為機體提供營養(yǎng)的雙重功效，影響著機體的一切代謝合成。具有抗氧化性質(zhì)的多肽類物質(zhì)稱為抗氧化活性肽。植物抗氧化活性肽能夠消除自由基，抑制或消除以及減緩氧化反應(yīng)，在食品保鮮、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。

紫菜干品含粗蛋白質(zhì)25%～40%，且必需氨基酸含量高，而目前紫菜的利用大多仍停留在簡單出口和粗加工層面，沒有很好地開發(fā)利用。鑒于紫菜中蛋白質(zhì)含量較高，可以用作生產(chǎn)多肽的原料[2]。尋找技術(shù)合理、經(jīng)濟可行的方法分離純化酶解后的多肽是實現(xiàn)活性肽工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，作為現(xiàn)代高新分離技術(shù)—膜分離技術(shù)可用于蛋白水解產(chǎn)物的分離、多肽及氨基酸混合物的分離與脫鹽等。

酶解—膜分離是集酶促水解、廢液循環(huán)利用、產(chǎn)物連續(xù)分離純化等多步工序于一體，實現(xiàn)連續(xù)操作的有效模式，目前，已在實驗室規(guī)模上建立了酶—微濾膜（超濾膜、反滲透膜等）反應(yīng)器，并將其應(yīng)用于提取酶解產(chǎn)物的功能性成分[3]。我國在這方面也開展了一些研究工作，如采用超濾技術(shù)分離大豆肽[4]、超濾與離子交換技術(shù)分離紫菜ACEⅠ抑制肽[5]，曾慶祝等進行了酶解和反應(yīng)器的偶聯(lián)組合進行了扇貝酶解技術(shù)研究[6]，結(jié)果表明該模型大大提高了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率。作者采用酶解—膜分離技術(shù)從紫菜酶解產(chǎn)物中分離純化抗氧化多肽，并對工藝流程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物如紫菜多糖以及膳食纖維進行分離提取，以實現(xiàn)紫菜最大程度的綜合利用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

條斑紫菜：南通千鶴食品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司；中性蛋白酶：蘇柯漢生物工程科技有限公司；枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶：作者所在實驗室保存；其余為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器

722型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；高速冷凍離心機Himac CR22G：HITACHI集團；HH-4型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州市亞榮儀器有限公司；高速冷凍離心機、真空冷凍干燥機：日本日立公司；2 L超濾設(shè)備：上海弗立特實業(yè)有限公司；氨基酸分析液相色譜儀：美國Agilent公司；HP1100型高效液相色譜儀：美國Aglient公司。

1.3測定方法

1.3.1肽含量測定按照雙縮脲法-考馬斯亮藍法測定。

1.3.2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的測定蛋白轉(zhuǎn)化率X（%）以酶解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量占紫菜粗蛋白質(zhì)量百分比為計算方法。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率越大，酶解越充分。

1.3.3多肽得率的測定多肽得率Y（%）以最終冷凍干燥得到的多肽粉的質(zhì)量與紫菜干粉的質(zhì)量百分比為計算方法。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率（%）= A0-（As-Ac）/A0

式中，A0為2.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；As為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；Ac為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度值。

在517 nm處測定吸光值，重復(fù)3次，求得清除率的平均值。

1.3.5多糖質(zhì)量分數(shù)測定多糖質(zhì)量分數(shù)（%）= 0.9×（總糖質(zhì)量分數(shù)-還原糖質(zhì)量分數(shù)），其中，0.9為換算因子[7]。總糖用苯酚硫酸法測定，還原糖用3，5-二硝基水楊酸法測定。

1.3.6超氧陰自由基（O2-·）清除能力測定采用鄰苯三酚自氧法。取1.5 mL含有1 mmol/L EDTA的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.3）和0.5 mL樣品溶液加入比色管中混勻，加入1 mL用10 mmol/L鹽酸溶解的3 mmol/L鄰苯三酚，迅速混勻，在420 nm處每隔30秒測一次吸光度，3 min后結(jié)束，以時間對吸光度做回歸方程，其斜率即為超氧自由基生成的速度，記為△A/（min·s）。以水代替樣品溶液做對照△A/（min·c）。以1.5 mL水加入1.5 mL的Tris-HCl緩沖液做空白調(diào)零。

酶解液樣品清除超氧陰自由基的能力用清除率（%）表示，公式為（△A/（min·s）-△A/（min·c））/（△A/（min·s））。

1.3.7羥自由基（·OH）清除能力測定采用鄰氮二菲法。取0.5 mL樣品加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），接著加入0.5 mL用緩沖液溶解的1.8 mmol/L鄰二氮菲溶液和0.5 mL 1.8 mmol/L FeSO4水溶液，迅速混勻，最后加入0.5 mL 0.02%的H2O2，在37℃下水浴60 min，于536 nm下測其吸光值（As）。用水代替樣品作為對照（Ac）。用水代替樣品和H2O2作為空白（Ab）。以1.5 mL磷酸鹽緩沖液加入1.5 mL的水調(diào)零。

酶解液樣品清除羥自由基能力用清除率（%）= （As-Ac）/（Ab-Ac）

1.4試驗方法

1.4.1紫菜抗氧化肽膜分離工藝紫菜干品→粉碎機（60目篩網(wǎng)）粉碎→烘干→酶解→離心→超濾→納濾→冷凍干燥，具體過程見圖1。

圖1　酶解紫菜制備抗氧化肽綜合利用工藝圖Fig. 1 Comprehensive utilization of antioxidative peptide from enzymatic hydrolyzed laver

1.4.2紫菜多糖的分析測定酶解后經(jīng)超濾截留的溶液中含有大部分的紫菜多糖，含量按照1.3.5的測定方法測定，其體外抗氧化性能按照1.3.6和1.3.7的測定方法測定。

1.4.3膳食纖維的分析測定根據(jù)AOAC 991.43-1994的分析方法，樣品經(jīng)高溫淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶進行酶解消化以去除蛋白質(zhì)、淀粉，酶解后樣液經(jīng)乙醇沉淀、過濾，殘渣用乙醇和丙酮沖洗后干燥稱質(zhì)量，得出總膳食纖維（TDF）質(zhì)量分數(shù)，需要通過測定蛋白質(zhì)和灰分質(zhì)量分數(shù)進行校正。其中，蛋白質(zhì)和灰分質(zhì)量分數(shù)均用國標法進行測量。不溶性膳食纖維（IDF）和可溶性膳食纖維（SDF）的測定是將樣品酶解后直接過濾，殘渣經(jīng)干燥后稱質(zhì)量，得到IDF；濾液用4倍體積95%的乙醇沉淀，然后依次過濾、干燥、稱質(zhì)量，即得到SDF。同樣，IDF和SDF的質(zhì)量分數(shù)需要通過測定蛋白質(zhì)和灰分質(zhì)量分數(shù)進行校正。

1.4.4抗氧化型護膚霜的初探按照下列配方配制普通型護膚霜：A相：十八醇（4%）角鯊?fù)椋?%）GTCC（3%）Brij72（1.5%）Brij721（2%）；B相：甘油（4%）1%的卡波940（20%）透明質(zhì)酸（1%）。在油相A和水相B加熱溶解后，將A相加入到B相中，同時用玻璃棒同一方向攪拌防止凝固，直到攪拌成均質(zhì)狀態(tài)，最后加兩地香精和三乙醇胺調(diào)節(jié)pH為中性，即制成水包油型護膚霜。將紫菜抗氧化肽按照不同濃度加入到到B相體系中，如上相同操作即制得抗氧化性護膚霜。

溶解護膚霜的緩沖液體系為乙醇∶三氯甲烷=1∶1，稱取0.5 g護膚霜充分溶于5 mL緩沖液中，然后5 000 r/min離心5 min，取上清液按照標準條件測定其DPPH清除率，與不加紫菜抗氧化肽的樣品進行比較。

2　結(jié)果與討論

2.1紫菜抗氧化肽膜分離

該工藝得到的紫菜抗氧化肽主要為小分子肽，相對分子質(zhì)量1 000以下小肽占94%，最終肽質(zhì)量濃度為5.78 mg/mL，回收率達62%，得率達18%，0.5 mg/mL多肽液的DPPH自由基清除率為68.5%。

超濾截留液中的紫菜多糖經(jīng)HPLC測定其相對分子質(zhì)量范圍為13 300～69 000。對其進行體外抗氧化性能，結(jié)果表明，相同質(zhì)量濃度下的紫菜多糖對超氧自由基的清除率略大于羥自由基，隨著質(zhì)量濃度的增加，紫菜多糖對各自由基的清除率也隨之增加。1.0 mg/mL的紫菜多糖羥自由基和超氧自由基清除率分別達到20.62%和42%。

本工藝經(jīng)過酶解后的紫菜殘渣中仍含有大量的膳食纖維，其中總膳食纖維質(zhì)量分數(shù)為36.6%，可溶性膳食纖維為23.5%，總回收率達到85%。

2.2加熱預(yù)處理對紫菜蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

以酶解后紫菜蛋白轉(zhuǎn)化率為指標，分析加熱預(yù)處理對紫菜蛋白轉(zhuǎn)化率的影響。對紫菜蛋白進行加熱預(yù)處理可以使蛋白質(zhì)緊密的結(jié)構(gòu)松散開來，有利于暴露出蛋白酶結(jié)合位點，更利于酶解。將紫菜溶液在85℃下加熱15 min，冷卻至室溫后開始酶解過程，同時與未經(jīng)預(yù)處理的紫菜溶液進行比較，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，經(jīng)過加熱預(yù)處理的紫菜蛋白的轉(zhuǎn)化率明顯高于未處理的紫菜蛋白轉(zhuǎn)化率，前者是后者的1.17倍。加熱預(yù)處理提高了紫菜蛋白轉(zhuǎn)化率，因此在酶解前進行加熱預(yù)處理是可行的。

表1　加熱預(yù)處理對蛋白轉(zhuǎn)化率的影響Table 1 Effect of pretreating on protein conversion rate

2.3不同因素對超濾的影響

以超濾速度、多肽回收率、DPPH自由基清除率為指標，確定適宜的樣液稀釋倍數(shù)、超濾濃縮倍數(shù)、pH、壓力等因素。

2.3.1稀釋倍數(shù)對超濾的影響紫菜酶解液中含一定量的紫菜多糖，導(dǎo)致樣液粘度很大，若不進行稀釋直接超濾，超濾速度會由于濃差極化現(xiàn)象越來越慢，而且含有多糖的紫菜酶解液可能會吸附在超濾膜上，增加膜清洗的難度，影響膜的二次使用。因此將紫菜酶解液進行稀釋處理，稀釋1.2、1.6、2、2.4倍進行實驗，結(jié)果見圖2。

圖2　稀釋倍數(shù)對多肽回收率等因素的影響Fig. 2 Effect of UF dilution multiple on peptide recovery rate

樣液稀釋倍數(shù)越大，超濾速度越快，但同時多肽的損失也越大，考慮到多肽回收率以及DPPH自由基清除率，選擇將樣液稀釋1.6倍再進行超濾操作。

2.3.2濃縮倍數(shù)對超濾的影響超濾是分離樣液中不同相對分子質(zhì)量組分的過程。因此按照相對分子質(zhì)量劃分有超濾透過液和超濾截留液，自定義超濾濃縮倍數(shù)=V原液/V超濾截留液。倍數(shù)小會導(dǎo)致分離不徹底，倍數(shù)大會造成資源浪費。因此選擇合適的濃縮倍數(shù)很重要，選擇3、4、5、6四組超濾濃縮倍數(shù)進行實驗，以超濾速度、多肽回收率、DPPH自由基清除率為指標選擇最佳的濃縮倍數(shù)。

由圖3可以看出，濃縮5倍的實驗組不僅多肽回收率最高，而且超濾透過液對DPPH自由基清除率也較高，并且多糖回收率也最高，因此超濾濃縮倍數(shù)選擇5倍。

圖3　濃縮倍數(shù)對多肽回收率等因素的影響Fig. 3　 Effect of concentration multiple on peptide recovery rate

2.3.3 pH對超濾的影響pH值不僅影響料液的DPPH自由基清除能力，而且也會在超濾過程中由于電荷不同于超濾膜影響著超濾速度，從超濾速度、多肽回收率、超濾透過液的DPPH清除率3個方面考察pH的影響。

由圖4看出，在相同條件下，pH 8.5的紫菜抗氧化肽的自由基清除率明顯高于其他pH，這是因為該紫菜抗氧化肽的最適作用pH為偏堿性。

圖4　pH值對多肽回收率等因素的影響Fig. 4 Effect of pH on peptide recovery rate

2.4不同因素對納濾的影響

以納濾速度、多肽回收率以及納濾截留液的DPPH自由基清除率為指標，確定最佳的納濾膜分子量、納濾倍數(shù)以及pH。

2.4.1膜相對分子質(zhì)量對納濾的影響采用液相色譜柱TSKgel 2000 SWxl對超濾透過液的相對分子質(zhì)量進行了分析，結(jié)果見圖5。

圖5　紫菜酶解液超濾透過液相對分子質(zhì)量分布Fig. 5 Molecular weight distribution of UF permeate

可以看出，紫菜抗氧化肽多為小分子肽，相對分子質(zhì)量多在1 000以下，選用市場上常用的500 和300的納濾膜，比較納濾截留液的各指標。

結(jié)果顯示300的納濾膜濾出速度很慢，這可能是因為膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)很緊密，膜孔很小導(dǎo)致大分子物質(zhì)通過時造成堵塞，因此采用500納濾膜。

2.4.2納濾倍數(shù)對納濾的影響與超濾相同，納濾過程有納濾透過液和納濾截留液，自定義納濾濃縮倍數(shù)=V原液/V納濾截留液。納濾倍數(shù)選擇3、4、5、6四組進行實驗，以納濾速度、多肽回收率、DPPH自由基清除率為指標選擇最佳的濃縮倍數(shù)。

由圖6可以看出，濃縮4倍的實驗組不僅速度較快，而且多肽回收率也最高，同時納濾截留液的自由基清除率也最強，選擇納濾濃縮4倍再進行冷凍干燥以得到固體粉末。

圖6　納濾濃縮倍數(shù)對多肽回收率等因素的影響Fig. 6 Effect of NF dilution multiple on peptide recovery rate

2.5紫菜抗氧化肽最適作用pH

將紫菜抗氧化肽配制成1 mg/mL的樣液，置于不同pH的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置1 h，在標準條件下測定其DPPH自由基清除率。

圖7　pH值對紫菜抗氧化肽自由基清除率的影響Fig. 7 Effect of pH on DPPH scavenging activity of laver antioxidant peptide

紫菜抗氧化肽在堿性條件下比酸性條件下的DPPH清除率更高，其中在pH 8.0～pH 8.5自由基清除率最高，達到85%左右。

2.6紫菜抗氧化肽耐熱性

將0.5 mg/mL的紫菜抗氧化肽置于40、50、60、70、80℃的水浴鍋中保溫6 h，每隔1小時取樣，冷卻至室溫后測其抗氧化活性，見圖8。

可以看出，經(jīng)80℃處理6 h后的紫菜抗氧化肽仍保留83%左右的相對DPPH自由基清除率，說明該抗氧化肽有良好的耐熱性。

2.7紫菜抗氧化肽在護膚霜中的應(yīng)用初探

將紫菜抗氧化肽按不同體積分數(shù)0.5%、1%、1.5%、2%添加到護膚霜的配料中，并與原多肽液以及空白組進行比較，見圖9。

圖8　溫度對紫菜抗氧化肽自由基清除率的影響Fig. 8 Effect of temperature on DPPH scavenging activity of laver antioxidant peptide

圖9　添加紫菜抗氧化肽的護膚霜對DPPH自由基的清除率Fig. 9 Effect of adding laver antioxidant peptide on skin cream

可以看出，制備的抗氧化潤膚霜的DPPH清除率隨著添加量的增加而增加，且與原液相比，DPPH自由基清除率基本保持不變，表明該工藝生產(chǎn)的紫菜抗氧化肽可以用作添加劑加入到護膚霜中提高產(chǎn)品的抗氧化能力，為開發(fā)新型護膚霜提供了有用依據(jù)。

3　結(jié)語

選用適當?shù)慕亓粝鄬Ψ肿淤|(zhì)量的超濾膜和納濾膜，在一定條件下，可以將酶解產(chǎn)物中的抗氧化多肽分離出來。本研究采用酶解—膜分離技術(shù)從紫菜酶解產(chǎn)物中分離純化抗氧化多肽，并對工藝流程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物如紫菜多糖以及膳食纖維進行分離提取，以實現(xiàn)紫菜最大程度的綜合利用。該工藝流程經(jīng)原料預(yù)處理和條件優(yōu)化后，抗氧化肽回收率達到73.1%，多糖回收率達到55%，膳食纖維回收率達85%，同時提高了該抗氧化肽的自由基清除能力，建立了一種可行的紫菜綜合利用途徑。紫菜抗氧化多肽屬于天然產(chǎn)物、易于獲得，相對分子質(zhì)量小，該綜合利用工藝為紫菜抗氧化肽大規(guī)模生產(chǎn)并在化妝品領(lǐng)域領(lǐng)域上的應(yīng)用提供了理論和技術(shù)支持。

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Study on the Preparation of Antioxidative Peptides from Enzymatic Hydrolysis of Laver and Their Comprehensive Utilization

LIU Dondong，TIAN Yaping*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：This study integrate enzymatic reaction with several membrane technologies to construct a method for comprehensive utilization of antioxidant peptide and other active substances from laver. The hydrolysate of laver was separated and purified through ultrafiltration（10 kDa cut-off molecular weight）and nanofiltration（500 Da cut-off molecular weight）. After optimizing the operation parameters of membrane separation，recovery rates of antioxidant peptide，polysaccharide，dietary fiber，and peptide reached 73.1%，55%，85%，and 18%，respectively. The peptides from laver showed the DPPH scavenging activity. The DPPH scavenging activity of 0.5 mg/mL nanofiltration peptide solution was up to 68.5%. Furthermore，the optimum pH value of laver antioxidant peptide was 8.5. Meanwhile，these peptides showed a good stability，it retained about 83% relative scavenging activity of DPPH radical after heated at 80℃for 6 h.

Keywords：laver，antioxidant peptide，membrane technology，comperhensive utilization

*通信作者：田亞平（1964—），女，安徽淮南人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物活性物質(zhì)方面的研究。E-mail：yapingtian@hotmail.com

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)支撐計劃項目（BE2013358）。

收稿日期：2014-09-03

中圖分類號：Q 819

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0166—07