芪精愈消膠囊薄層鑒別及含量測定研究

許廣華，王　虎，李小偉，陳　剛

(太和縣中醫(yī)院藥劑科，安徽 太和　236600)

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芪精愈消膠囊薄層鑒別及含量測定研究

許廣華，王虎，李小偉，陳剛

(太和縣中醫(yī)院藥劑科，安徽 太和236600)

摘要：目的 制定芪精愈消膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法鑒別處方中的黃芪、五味子；采用HPLC法測定葛根中葛根素的含量，Agilent C(18)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—0.4%磷酸溶液(25∶75)，檢測波長250 nm。結(jié)果黃芪、五味子薄層鑒別斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾，可作為定性鑒別；含量測定中葛根素在0.169 4～0.846 8 μg范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為A=4375 947C+1 708(r=0.999 9),回收率平均為99.36%，RSD=0.98%(n=5)。 結(jié)論該方法操作簡單，專屬性和重現(xiàn)性良好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞:芪精愈消膠囊；五味子；黃芪；葛根；葛根素

芪精愈消膠囊為太和縣中醫(yī)院制劑，由黃芪、五味子、葛根、黃精等七味中藥制成。具有益氣養(yǎng)陰、扶正固本的功效，用于口渴、多飲、多尿、乏力、多汗諸癥。處方中所用藥材，化學(xué)成分比較清楚，主要有黃芪甲苷、葛根素、五味子乙素等。為了更好的控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全有效，本文對處方中的黃芪和五味子進(jìn)行了薄層鑒別，同時(shí)采用HPLC法測定了葛根中葛根素的含量。

1儀器與試藥

1.1 儀器LC-1220型高效液相色譜儀(安捷倫)；ZF-2型三用紫外儀(上海安亭電子儀器廠)；HS-180型超聲波清洗機(jī)(安徽金尼克機(jī)械有限公司)；HH型水浴鍋(江蘇金壇中大儀器廠)；101-1A型數(shù)顯恒溫干燥箱(滬粵科學(xué)儀器廠)；硅膠G板、硅膠GF254板(50 mm×100 mm，青島海洋化工廠分廠)。

1.2試藥 葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110752-200209)；五味子乙素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110765-200407)；五味子對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號120922-201108)；黃芪對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號121462-201003)；芪精愈消膠囊(太和縣中醫(yī)院，批號：20140603、20140606、20140609)；甲醇為色譜純，水為重蒸水；其余試劑均為分析純。

2薄層鑒別

2.1黃芪薄層鑒別 取本品混勻的內(nèi)容物2 g，加乙酸乙酯20 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為樣品溶液。再取按芪精愈消膠囊制備工藝生產(chǎn)的不含黃芪的樣品，同法制成陰性對照溶液。另取黃芪對照藥材1 g，照樣品溶液的制備方法制成藥材對照溶液。按《中國藥典》2015版四部0502薄層色譜法，分別吸取以上三種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板(105℃活化30 min)上，展開劑為三氯甲烷—甲醇(17∶1)[1]，展開，取出，晾干，噴以碳酸鈉試液，置紫外燈365 nm下檢視。樣品色譜在與對照色譜相對應(yīng)的位置上，顯顏色相同的熒光斑點(diǎn)。而陰性對照在此位置處無斑點(diǎn)，方法專屬性強(qiáng)，可作為本品中黃芪的鑒別,見圖1。

圖1　黃芪TLC圖

注：1.批號20140603樣品；2.批號20140606樣品；3.批號20140609樣品；4.黃芪對照藥材；5.陰性對照樣品 。

2.2五味子薄層鑒別[2]取本品混勻的內(nèi)容物4 g，加三氯甲烷30 mL，浸泡1 h，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯使溶解，作為樣品溶液。再取按芪精愈消膠囊制備工藝生產(chǎn)的不含五味子的樣品，同法制成陰性對照溶液。另取五味子乙素對照品，加甲醇制成1 g·L-1的溶液，作為對照品溶液。按《中國藥典》2015版四部0502薄層色譜法，分別吸取以上樣品溶液與陰性對照溶液各5 μL、對照品溶液2 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板(105℃活化30 min)上，展開劑為石油醚(30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸(15∶5∶1)的上層溶液，展開，取出，晾干，置紫外燈254 nm下檢視。樣品色譜在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯顏色相同的熒光斑點(diǎn)。而陰性對照在此位置處無干擾，方法專屬性強(qiáng)，可作為本品中五味子的鑒別，見圖2。

3含量測定

3.1波長的選擇 以甲醇為空白對照，對葛根素在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。結(jié)果葛根素在250.05 nm波長處有最大吸收(見圖3)。參照藥典中葛根藥材的含量測定條件，故選擇250 nm作為檢測波長[3]。

圖2　五味子TLC圖

注：1.批號20140603樣品；2.批號20140606樣品；3.批號20140609樣品；4.五味子乙素對照品；5.五味子對照藥材；6.陰性對照樣品。

圖3　 葛根素波長掃描

3.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇—0.4%磷酸溶液(25∶75)[4-8]；檢測波為250 nm。理論板數(shù)以葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，分離度為1.8，拖尾因子為0.99。

3.3溶液的制備

3.3.1對照品溶液的制備精密稱定葛根素對照品若干，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

3.3.2供試品溶液的制備[9]取裝量差異項(xiàng)下混勻的膠囊內(nèi)容物，取約0.35 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲20 min，取出，放冷后，加甲醇定容。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4缺葛根陰性樣品測定取按芪精愈消膠囊制備工藝生產(chǎn)的不含葛根的樣品，按“3.3.2”法制成陰性樣品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果表明：陰性樣品的HPLC圖譜中在與對照品葛根素HPLC圖譜中相同的保留時(shí)間處無吸收峰，陰性無干擾，方法專屬性較強(qiáng),見圖4。

3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取葛根素對照品2.117 mg，甲醇超聲溶解，定容至25 mL。照“3.2”色譜條件，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，測得峰面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo))。其回歸方程：A=4 375 947C+1 708，r=0.999 9。由圖5知，葛根素在0.169 36～0.846 8 μg范圍內(nèi)線性良好。

圖4　 專屬性試驗(yàn)

。

圖5　葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取芪精愈消膠囊(批號：20140603)，按“3.3.2”法制成供試液。分別在配制后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測得葛根素的峰面積。結(jié)果葛根素平均峰面積2 921 813，RSD=1.49%，表明在24 h內(nèi)樣品較穩(wěn)定。

3.7精密度試驗(yàn)取濃度為0.084 68 g·L-1的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，記錄峰面積值。結(jié)果葛根素的平均峰面積為1 849 360，RSD=1.56%，表明該儀器精密度能滿足試驗(yàn)要求。

3.8重復(fù)性試驗(yàn)取芪精愈消膠囊(批號：20140603)樣品6份，按“3.2”條件進(jìn)樣測定。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得葛根素的含量。結(jié)果樣品平均含量為每粒3.54 mg，RSD=1.36%，表明方法重現(xiàn)性較好。

3.9加樣回收試驗(yàn)取芪精愈消膠囊(批號：20140603，含量：0.962 0%)樣品適量，精密加入一定量的葛根素對照品，按“3.3.2”法制成供試品溶液，再按“3.2”條件測定[10-13],結(jié)果見表1。樣品的平均回收率為99.36%，RSD=0.98%。表明樣品回收率良好，方法準(zhǔn)確度較高。

3.10樣品測定及含量限度的確定 對投料的葛根藥材及三批成品制劑進(jìn)行含量測定，計(jì)算轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表2。

表1　 加樣回收試驗(yàn)

表2　 葛根素轉(zhuǎn)移率試驗(yàn)

不同批次藥材含量測定結(jié)果表明，葛根素含量分別為3.73%、3.81%、4.01%，處方中每粒含葛根生藥0.111 1 g，則制劑中理論葛根素含量分別為每粒4.14、4.23、4.46 mg，葛根素轉(zhuǎn)移率分別為60.4%、61.5%、58.3%?！吨袊幍洹?015年版一部葛根含量限度為2.4%(24 mg·g-1)，則成品理論最低含量為每粒2.67 mg。根據(jù)轉(zhuǎn)移率計(jì)算，制成制劑后成品含量限度為每粒1.57～1.64 mg。經(jīng)多批制劑含量測定結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)際，葛根素含量限度暫定為不少于每粒2.0 mg。

4結(jié)果與討論

試驗(yàn)對處方中葛根、黃精等藥味進(jìn)行了鑒別研究。但葛根素陰性有干擾，黃精供試品分離效果較差，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)暫僅收錄了黃芪與五味子的薄層鑒別，其他鑒別有待進(jìn)一步研究。

在含量測定供試品溶液的制備中，為了充分提取樣品中的葛根素，采取同一批樣品，分別超聲和回流提取處理。測定結(jié)果表明二者含量相差不大，而超聲更方便，故選擇超聲提取。而在超聲提取的過程中，又考察了提取溶劑甲醇、乙醇和處理時(shí)間10、20、30 min的影響。結(jié)果表明以甲醇為溶劑，超聲處理20 min，提取效果最佳。

試驗(yàn)中進(jìn)行了系統(tǒng)適用性與耐用性考察。薄層鑒別分別考察了不同廠家薄層板、不同人員及不同實(shí)驗(yàn)室的影響，結(jié)果方法重現(xiàn)性較好，耐用性強(qiáng)。含量測定分別考察了分離度、重復(fù)性、流動(dòng)相比例的變化、不同色譜柱及柱溫的影響。結(jié)果分離度均>1.5，重復(fù)性RSD=0.69%，故流動(dòng)相比例的變化、柱溫對含量測定的影響不大；不同色譜柱僅保留時(shí)間有所不同，分離度、不對稱性均符合要求。表明方法分離度高，重復(fù)性好，耐用性較強(qiáng)。

試驗(yàn)中以甲醇—水系統(tǒng)為流動(dòng)相時(shí)，峰形拖尾嚴(yán)重。而在水相中加入適量磷酸后，峰形改善明顯，拖尾因子在合適的范圍內(nèi)，說明pH值對測定有一定的影響。通過對不同濃度的磷酸溶液的考察，最終選擇甲醇—0.4%磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

試驗(yàn)中的鑒別及含量測定方法簡便快速，重現(xiàn)性好，可用于本制劑的質(zhì)量控制，為新制劑的注冊提供試驗(yàn)依據(jù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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Study on TLC identification and content determination of qijing yuxiao capsules

XU Guang-hua，WANG Hu，LI Xiao-wei,et al

(DepartmentofPharmacy,TaiheTraditionalChineseMedicineHospital,Taihe,Anhui236600,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the quality standard of qijing yuxiao capsules. MethodsThe TLC method was used to identify schisandra chinensis,and astragalus membranaceus.HPLC method was used to determine the contents of puerarin. The optimal conditions of the separation and detection were achieved on a Agilent C18 column with a mobile phase consisting of methanol-0.4% phosphoric acid solution(25∶75) at the detective wavelength of 250 nm. Results TLC spots of radix astragalus and schisandra chinensis were clear and negative without interference, which can be used as qualitative method. The contents of puerarin had a good linear relation with peak area(r=0.999 9), when ranging from 0.169 4～0.846 8 μg. and equation was A=4375 947C+1 708.The average recovery of puerarin was 99.36% and RSD was 0.98%(n=5).Conclusion The method is simple,with good specificity and reproducibility,and can be used as the quality control for this preparation.

Key words：qijing yuxiao capsules;schisandra chinensis;astragalus membranaceus;root of kudzu vine;puerarin

(收稿日期：2015-09-30，修回日期：2016-02-10)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.012

通信作者：陳剛，男，副主任中藥師，研究方向：醫(yī)院中藥制劑的工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：395522179@qq.com