手十二井穴放血對pMCAO大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響

陳宇岑,王振國,陳澤林

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手十二井穴放血對pMCAO大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響

陳宇岑1,王振國2,陳澤林3

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.西安中醫(yī)腦病醫(yī)院,西安 710068;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,天津300193)

目的 觀察手十二井穴放血對永久大腦中動脈栓塞(Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,pMCAO)大鼠局灶性腦缺血損傷早期腦組織血腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)通透性的影響。方法 選用雄性Wistar大鼠,隨機分為假手術(shù)組、模型組和放血組,用Longa法建立大腦中動脈栓塞模型后在5 h、24 h、72 h 3個時間點尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)(Evans Blue,EB),通過測量提取腦組織中EB吸光度來評估EB的滲出量,以觀察BBB的通透性。結(jié)果 模型組大鼠腦組織EB滲出量要顯著高于假手術(shù)組(＜0.01),放血組大鼠的腦組織EB滲出量低于模型組(＜0.01)。結(jié)論 手十二井穴刺絡(luò)放血可以降低pMCAO大鼠血腦屏障通透性,其效果在缺血后24 h和72 h均極為顯著。

穴,井;手十二井穴;放血療法;永久大腦中動脈栓塞;大鼠;血腦屏障通透性

腦血管病是中老年人最常見疾病之一,具有發(fā)病率高、致殘致死率高、復(fù)發(fā)率高等特點,其中缺血性中風(fēng)所占比例最大。從目前對中風(fēng)病治療措施的研究來看,大多注重后遺癥的治療,研究發(fā)現(xiàn),及時有效的急救措施對于改善后遺癥和減輕病死率具有重要的臨床意義[1]。腦水腫是腦缺血后的重要病理生理改變,是中風(fēng)病早期死亡的重要原因,其病理機制與腦組織血腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn),大鼠伊文思藍(lán)(Evans Blue, EB)在局灶性持續(xù)性腦缺血早期(0.5 h)即有滲出[2],本研究旨在觀察作為急救之法的井穴放血法對于永久大腦中動脈栓塞(Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,pMCAO)大鼠早期腦組織血腦屏障通透性是否也有改善作用,為中醫(yī)在缺血性腦血管病的中早期介入提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用體重220～250 g健康雄性Wistar大鼠90只,清潔級,由天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為9組,每組10只。室溫保持在(22±2)℃,分籠飼養(yǎng),自由飲水進食,常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后進行實驗,實驗前禁食不禁水24 h。

1.2 實驗儀器和試劑(見表1)

1.3 動物分組模型與制備

選用雄性Wistar大鼠,在SPSS16.0統(tǒng)計軟件中生成隨機數(shù)字表,將動物隨機分為9組,即5 h假手術(shù)組、模型組、放血組,24 h假手術(shù)組、模型組、放血組,72 h假手術(shù)組、模型組和放血組。

動物模型制備方法參照Longa法[3],假手術(shù)組處理方法同模型組,只是插線過程中將魚線插到頸動脈分叉處即可。放血組動物于清醒后進行評分,癥狀符合納入標(biāo)準(zhǔn)即刻進行治療。

模型納入與剔除標(biāo)準(zhǔn):大鼠麻醉清醒后進行神經(jīng)功能評分,采用Zea-longa的分級標(biāo)準(zhǔn)在術(shù)后進行行為學(xué)評分,0分為無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀,活動正常;1分為對側(cè)前肢不能完全伸直;2分為爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分為行走時向左側(cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走,意識喪失[3]。1分以下及3分以上剔除,并用同一批次的大鼠制成合格模型后補足數(shù)目。

放血組處理方法:用膠布處理毫針針尖,使其刺入皮膚深度限定在1 mm。用處理后的毫針于以下諸穴位點刺放血,出血量以血盡為止。取位于大鼠雙側(cè)前肢端的十二井穴。穴位定位方法采用比較解剖學(xué),參考人體相應(yīng)穴位解剖標(biāo)志,在大鼠前肢各趾的相應(yīng)部位選取。每日治療1次。

表1 儀器試劑清單

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定

各組動物在處死前1 h由尾靜脈注射2%EB (4 mL/kg),可以明顯地觀察到大鼠的全身迅速變藍(lán)。1 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,之后置于手術(shù)臺,開胸,暴露心臟。從左心室灌注生理鹽水以清除血管內(nèi)EB,直到右心耳流出無色液體為止。迅速斷頭取腦,取藍(lán)染側(cè)腦組織皮質(zhì),稱重,放入3 mL甲酰胺溶液中,54℃水浴箱中提取24 h,離心15 min (3000 r/min),取上清液在722分光光度計中測吸光度(波長為620 nm),甲酰胺作空白對照。

1.5 伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及腦組織伊文思藍(lán)含量的計算

1.5.1 伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:準(zhǔn)確稱取干燥的伊文思藍(lán)10 mg,充分溶解于10 mL甲酰胺溶液中,伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確吸取30mL伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液(相當(dāng)于伊文思藍(lán)30mg),溶于6 mL甲酰胺溶液,充分混勻溶解,得到濃度為5mg/mL的伊文思藍(lán)溶液6 mL,順次以甲酰胺稀釋,得到終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/mL的伊文思藍(lán)溶液各3 mL。用722分光光度計在622 nm以甲酰胺溶液作為空白管參比,測定吸光度A值,以溶液濃度為橫坐標(biāo),以溶液吸光度A值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)直線回歸后,得直線回歸方程為Y=0.062X＋0.001, R2=0.999(見圖1)。表明EB含量與EB吸光度密切相關(guān)。

1.5.2 伊文思藍(lán)含量計算

腦組織伊文思藍(lán)含量(mg/g濕腦)=A×甲酰胺量(mL)/腦組織濕重(g),其中A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得的樣本伊文思藍(lán)含量(mg/mL)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較采用單因素方差分析,＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比,模型組EB滲出量在5 h、24 h、72 h都要高于同時間點的假手術(shù)組,有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01),表明造模后血腦屏障通透性顯著增高,模型制備成功;EB在缺血后5 h即有明顯滲出,之后逐漸增加,直到24 h,缺血后72 h EB滲出有所下降,但仍顯著高于假手術(shù)組;各相同時間點的放血組與模型組相比,在5 h時,放血組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05);在24 h與72 h,放血組EB滲出量均低于模型組,有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.01),提示放血組在24 h和72 h對于血腦屏障的通透性都有明顯的改善作用(見表2、圖2)。

表2 各組大鼠腦組織伊文思藍(lán)滲出量 (±s,mg/g)

表2 各組大鼠腦組織伊文思藍(lán)滲出量 (±s,mg/g)

組別n5 h24 h72 h 假手術(shù)組102.91±1.333.05±1.052.71±1.23 模型組106.11±1.681)9.56±1.711)5.72±1.381) 放血組105.67±1.471)5.12±1.542)3)3.80±1.383)

注:與同時間點假手術(shù)組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與同時間點模型組比較3)＜0.01

3 討論

十二井穴刺絡(luò)放血法為中醫(yī)傳統(tǒng)的急救措施之一,古籍中多有記載?！端貑枴め樈狻?“菀陳則除之者,出惡血也?！薄夺樉拇蟪伞穂4]:“凡中風(fēng)跌倒,卒暴昏沉,……急以三棱針刺手十二井穴,當(dāng)去惡血?！笨梢娫诿鞔郧?十二井穴放血療法就已應(yīng)用于臨床治療中風(fēng)病。近年來,有不少針灸學(xué)家就井穴放血法治療中風(fēng)病的臨床療效作出了初步的臨床研究和評價[5-8],但單純運用井穴放血治療中風(fēng)的臨床研究仍然較少,大多集中在井穴放血聯(lián)合針刺、中西醫(yī)藥物等。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9-10],井穴放血對pMCAO大鼠缺血后48 h、72 h腦水腫有一定改善作用,其療效與甘露醇相當(dāng);井穴放血可以降低pMCAO大鼠缺血后48 h和72 h血腦屏障通透性,同時在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與模型組相比,井穴組血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的破壞程度在48 h和72 h均有所減輕。

本實驗井穴放血法對模型大鼠24 h和72 h血腦屏障通透性均有所降低,其機理可能是該療法能調(diào)節(jié)細(xì)胞外K﹢、Na﹢失衡,改變局部微循環(huán)血量,改變血液性狀和血流速度,從而影響了血管通透性,調(diào)節(jié)了體液循環(huán)[11],促進腦血流的改善,緩解腦組織的缺血缺氧狀況,使皮質(zhì)缺血區(qū)的內(nèi)環(huán)境發(fā)生良性改變[12]。

從中醫(yī)學(xué)角度來講,中風(fēng)的病機總屬陰陽失調(diào)、氣血逆亂?！肚ど狻?“以三棱針刺手指十二井穴,當(dāng)去惡血,治一切暴死惡候,不省人事,及絞腸痧,乃起死回生妙訣?！本槭?jīng)脈陰陽之氣始發(fā)之處,羅天益在此基礎(chǔ)上對中風(fēng)病的治療提出了大接經(jīng)刺法[13-14],他認(rèn)為中風(fēng)病是由于經(jīng)氣不通、氣血不暢、左右不能環(huán)周所致,而針刺位于四末的井穴可使十二經(jīng)氣相通,左右環(huán)周,不失為治療偏枯證的有效療法。中風(fēng)的病位在腦,《靈樞·邪氣藏府病形》:“十二經(jīng)脈,三百六十五絡(luò),其血氣皆上行于面而走空竅?！比斫?jīng)脈可以通過頭面空竅而與腦相聯(lián)系,故井穴放血能通過調(diào)理十二經(jīng)脈氣血,進而改善腦的功能。

缺血性腦病的病理機制復(fù)雜,目前認(rèn)為與能量耗竭、細(xì)胞內(nèi)Ca2﹢超載、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、血腦屏障受損等因素有關(guān)[15]。血腦屏障是機體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),它的損害直接影響神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,在缺血性中風(fēng)發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。本實驗在一定程度上證實了手十二井穴放血對腦缺血中早期血腦屏障的通透性起到了調(diào)節(jié)作用,為針灸在缺血性腦病的中早期介入提供了一定的實驗依據(jù)。而井穴放血是如何引起血腦屏障通透性的變化以及引起這種變化的潛在分子機制,還有待進一步研究。

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The Effect of Hand Twelve Jing-Well Points Bloodletting on Blood-brain Barrier Permeability in PMCAO Rats

1,2,3.

1.300193,; 2.710068,; 3.300193,

Objective To investigate the effect of hand twelve Jing-Well points bloodletting on blood-brain barrier (BBB) permeability in the early stage of focal cerebral ischemic injury in rats withpermanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). Method Male Wister rats were randomized into sham operation, model and bloodletting groups. A model of middle cerebral artery occlusion was made by Longa's method. 2% Evans blue (EB) was injected into the caudal vein at three time points: 5, 24 and 72 hrs after model making. EB exudation amount was assessed by measurement of EB absorbance in brain tissue to observe BBB permeability. Result Cerebral EB exudation amount was significantly higher in the model group of rats than in the sham operation group (＜0.01) and significantly lower in the bloodletting group than in the model group (＜0.01). Conclusion Hand twelve Jing-Well points bloodletting can reduce blood-brain barrier permeability in pMCAO rats. Its effect is highly significant at 24 and 72 hrs after ischemia.

Points, Jing-Well; Hand twelve Jing-Well points; Bloodletting therapy; Permanent middle cerebral artery occlusion; Rats; Blood-brain barrier permeability

1005-0957(2016)12-1466-03

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1466

天津市科學(xué)技術(shù)委員會應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃一般項目(14JCYBJC25800)

陳宇岑(1991 - ),女,2014級碩士生,Email:cycsy22@163. com

陳澤林(1966 - ),男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,Email:chenze lin328@163.com

2016-02-20