顱針對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響

黃玉棟,聶焱,王志強,鄭雪峰

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顱針對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響

黃玉棟1,聶焱2,王志強3,鄭雪峰3

(1.福建莆田九五醫(yī)院,莆田 351100;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院,福州 350001;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福州 350122)

目的 觀察顱針對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積、血漿中SOD活性、MDA及NO含量的影響。方法 將SPF級SD雄性大鼠48只,隨機分成假手術(shù)組、模型組及顱針組。采用線栓法制備大鼠腦中動脈缺血(MCAO)模型,采用Longa EZ神經(jīng)功能評分方法評價大鼠神經(jīng)功能,采用TTC染色的方法測定大鼠腦梗死面積,并采用比色法檢測血漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量。結(jié)果 與假手術(shù)組相比,在第1、3、7天模型組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分均顯著降低(＜0.01)。經(jīng)TTC檢測發(fā)現(xiàn)顱針組腦梗死體積顯著小于模型組。同時與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血漿SOD活性降低(＜0.01),MDA和NO含量升高(＜0.01);與模型組比較,顱針治療后,血漿SOD活性升高(＜0.01),MDA、NO含量降低(＜0.01)。結(jié)論 顱針對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用,能提高腦缺血再灌注損傷大鼠血漿SOD活性,降低血漿MDA、NO含量。

電針;卒中;缺血再灌注損傷;氧化應(yīng)激;大鼠;頭針;顱針

隨著世界人口老齡化的加劇,腦卒中成為了世界上高致殘率、高死亡率、高發(fā)病率的一種疾病,給人類健康造成了巨大的威脅[1-3]。其中缺血性腦卒中已成為社會和醫(yī)學(xué)界關(guān)注的公共健康問題。長期以來,人們一直在探索治療腦卒中的有效方法,但迄今為止,尚未找到公認、安全、有效的治療方法。國內(nèi)外目前普遍認為發(fā)病3 h的溶栓治療是治療缺血性腦卒中最有效的治療方法,但由于溶栓要求嚴格的時間窗,且需嚴格控制適應(yīng)證,只有少數(shù)的患者有機會進行這一治療。因此,尋找安全有效的治療缺血性腦卒中的手段,在挽救患者生命的同時,也盡可能減輕缺血帶來的神經(jīng)功能的損傷,改善患者生活、生命質(zhì)量,使其早日恢復(fù)功能,也越來越受到重視。

顱針是福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院俞昌德教授根據(jù)中醫(yī)學(xué)經(jīng)絡(luò)腧穴理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)顱骨解剖的特殊結(jié)構(gòu)——顱骨縫,并在長期不斷的臨床實踐中探索出來的一種以骨縫取穴的創(chuàng)新頭針方法[4-5]。前期的臨床研究[6-7]表明,針刺急性腦梗死患者的顱骨縫區(qū),能明顯改善患者臨床癥狀,特別是在急性期介入顱針,對后期的神經(jīng)功能恢復(fù)有明顯的差異,但其具體的作用機制尚不明確。為了進一步明確顱針對腦缺血再灌注損傷的作用機理,本研究通過觀察針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量的影響,探討針刺治療缺血性腦卒中可能的作用機理,為腦卒中的針灸康復(fù)治療提供一定的實驗依據(jù)及新的臨床治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級SD大鼠,雄性,48只,體重240～280 g,由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,同時福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供SPF級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施,使用許可證號為SYXK(閩)2009-0001。實驗動物中心飼養(yǎng)條件為①SPF級實驗室;②標(biāo)準飼料及滅菌潔凈水;③室溫(25±2)℃,相對濕度55%～70%;④自由攝食飲水;⑤每日定時更換墊料,保持干燥;⑥維持12 h光照,晝夜循環(huán)。48只SPF級SD大鼠隨機分為3組,即假手術(shù)組16只,缺血再灌注模型組16只,顱針針刺組16只。各組中8只用于腦梗死面積測定,另外8只用于血漿中SOD活性及MDA及NO含量的測定。

1.2 主要材料、試劑和儀器

0.35 mm×13 mm毫針(蘇州醫(yī)療器械廠);NO、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所);ELX-800多功能酶標(biāo)儀(中國Tecan公司);低速離心機(上海儀分科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 模型制備

參照Longa EZ等[8]線栓法建立大鼠腦中動脈閉塞(MCAO)模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 mg/ 100 g體重),麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上,取頸正中切口,分離出左頸總動脈(common carotid artey,CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artey,ICA)及頸外動脈(external carotid artey,ECA),結(jié)扎ECA、CCA,用動脈夾夾閉ICA后,在ECA作一切口,從切口處插入硅膠包被的尼龍線,經(jīng)CCA分叉處,稍稍結(jié)扎CCA分叉的插線處,然后撤掉ICA遠端的動脈夾,將硅膠包被的尼龍線順勢緩緩送入,越過翼腭動脈直至顱內(nèi)大腦前動脈的近端,深度約18～20 mm時停止插線,實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。硅膠包被的尼龍線外留約1 cm,縫合皮膚。2 h后輕輕提拉所留線頭至有阻力,實現(xiàn)大腦中動脈再灌。假手術(shù)組只分離動脈,不結(jié)扎、插線。造模后4 h根據(jù)Longa EZ神經(jīng)功能評分方法對造模大鼠進行評分,以判斷造模是否成功,其中,0分及4分者被剔除,取評分1～3分的大鼠進行后續(xù)實驗。本實驗中造模大鼠評分均是2分或3分。

1.4 干預(yù)措施

顱針組取穴根據(jù)楊安峰《大鼠的解剖和組織》及林文注所介紹的動物穴位定位方法[9-10],即矢狀縫頭皮線(大鼠兩耳間連線的中點作一垂直線,截取鼻翼骨上緣至兩耳后緣間的距離)、冠狀縫頭皮線(大鼠兩側(cè)顴弓的后緣點作一弧線,截取兩側(cè)額嵴間的距離)、人字縫頭皮線(大鼠兩耳后緣之間作一弧線,截取兩側(cè)鼓骨上嵴的距離)。采用0.35 mm×13 mm毫針沿各顱骨縫頭皮線成15°角針刺,針刺后施以電針(電流0.3 mA,疏密波,疏波頻率20 Hz,密波頻率100 Hz),以大鼠出現(xiàn)頭部輕度抖動為度,留針30 min,每日1次。手術(shù)后24 h開始治療,共7 d。假手術(shù)組及模型組同樣抓取,不做其他任何處理。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評價

按Longa EZ神經(jīng)功能評分方法進行神經(jīng)功能缺損評分,評分表如表1。分值越高,損傷越嚴重。

表1 Longa EZ神經(jīng)功能評分方法

1.5.2 TTC法測定腦梗死面積

實驗結(jié)束后,取其中8只大鼠腹腔注射麻醉,腹腔注射麻醉后大鼠斷頭取腦,去掉嗅球、小腦和低位腦干,剩余部分在﹣20℃冰箱冷凍10 min,在冰盤上冠狀切成6片,迅速將腦片置于TTC染液中,37℃避光溫孵1 h,經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色,梗死區(qū)為白色。用軟件計算腦梗死面積占半腦面積的百分比。

1.5.3 血漿中SOD活性及MDA、NO含量的測定

實驗結(jié)束后,另取其中8只大鼠腹腔注射麻醉,于大鼠腹主動脈取血,血液置于含肝素鈉的采血管中,室溫靜置2 h后,4℃ 3000 r/min離心l0 min,分離血漿,根據(jù)NO、SOD、MDA試劑盒說明書,測定樣品中的SOD活力及MDA、NO的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行處理,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差表示,組間比較采用方差分析,＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

分別在造模后的第1、3、7天進行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評價,各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分見表2。結(jié)果顯示,在第1、3、7天模型組大鼠的神經(jīng)功能癥狀評分顯著高于假手術(shù)組(＜0.01,＜0.05),說明腦缺血再灌注可造成明顯的神經(jīng)功能缺損;顱針組在第1、3天的神經(jīng)功能癥狀評分均小于模型組,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(＞0.05),而第7天評分低于模型組,且有統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.05),說明顱針之后能夠提高大鼠的神經(jīng)功能,提示顱針對模型大鼠的神經(jīng)功能損傷具有改善作用。

表2 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,分)

表2 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,分)

組別n第1天第3天第7天 假手術(shù)組80.00±0.000.00±0.000.00±0.00 模型組82.78±0.932)2.75±0.892)2.11±0.001) 顱針組82.67±0.872.35±0.691.67±0.523)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.05

2.2 3組大鼠腦梗死面積比較

采用TTC染色的方法測定腦梗死的面積,結(jié)果如圖1所示。假手術(shù)組腦片染成均勻紅色,無梗死灶,模型組大鼠損傷側(cè)大腦出現(xiàn)明顯的梗死灶,而顱針組能縮小腦梗死范圍。以設(shè)假手術(shù)組梗死面積百分比為0作為對照,經(jīng)統(tǒng)計分析模型組腦梗死面積占(30.5±3.1)%,顱針組腦梗死面積占(21.3±2.0)%,模型組與顱針組比較有顯著性差異(＜0.05)。詳見圖2。

圖1 腦梗死組織切片圖

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05

2.3 3組大鼠血漿中NO、SOD、MDA比較

如表3所示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血漿SOD活性降低(＜0.01),MDA和NO含量升高(＜0.01);與模型組比較,顱針治療后,血漿SOD活性升高(＜0.01),MDA、NO含量降低(＜0.01)。

表3 3組大鼠血漿中NO、SOD、MDA的比較 (±s)

表3 3組大鼠血漿中NO、SOD、MDA的比較 (±s)

組別nNO(mmol/L)SOD(U/mL)MDA(nmol/mL) 假手術(shù)組819.15±3.37136.94±22.056.72±1.05 模型組835.31±7.031)75.11±5.011)12.39±2.431) 顱針組825.04±5.102)113.76±15.652)7.11±1.742)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

3 討論

缺血性腦卒中是由于腦部血流量減少引起的大腦缺血缺氧損傷。藥物療法和機械再灌注治療,尤其是抗血栓類藥物的使用已經(jīng)成為缺血性腦卒中急性階段的有效治療方法。但是,由于其治療時間窗較短,易引起顱內(nèi)出血等不良反應(yīng),僅有少數(shù)患者適用該種治療。因此,缺血性腦卒中患者除了極少數(shù)可恢復(fù)外,約3/4患者會留下輕重程度不一的后遺癥——神經(jīng)功能缺損,同時缺血性腦卒中溶栓后,過度灌注可加重腦水腫、顱內(nèi)高壓、神經(jīng)功能損傷的癥狀。腦卒中后的神經(jīng)功能缺損癥狀,如口眼歪斜,半身不遂,思維緩慢,甚至情緒抑郁等,是腦卒中后存活患者所遺留的最主要問題,不僅嚴重影響患者的日常生活質(zhì)量,同時漫長的病程及高額的治療費用,嚴重影響患者生活質(zhì)量,給社會和家庭造成嚴重的負擔(dān)[11-13]。因此,尋找安全有效的治療缺血性腦卒中的手段,在挽救患者生命的同時,也盡量減輕缺血帶來的神經(jīng)損傷,改善患者生活、生命質(zhì)量,使其早日恢復(fù)功能,是腦缺血中風(fēng)治療研究中的重點。

福建中醫(yī)藥大學(xué)俞昌德教授在長期的中醫(yī)針灸臨床實踐中探索出一種治療腦血管疾病的新型頭針療法——顱針療法。俞氏顱針是以現(xiàn)代顱骨解剖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)腧穴理論為指導(dǎo)的頭針療法。其中,顱骨由頂骨、額骨、顳骨、枕骨等多塊顱骨組成,各個顱骨毗鄰骨緣間由致密的結(jié)締組織而形成顱骨縫。顱骨縫間有導(dǎo)血管構(gòu)成內(nèi)外的通道,且與顱神經(jīng)、部分相伴的動靜脈血管及神經(jīng)感受器構(gòu)成錯綜交雜的解剖結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。另有研究發(fā)現(xiàn)[14],在每側(cè)顱骨的密集區(qū)域,腦膜中動脈穿過顱骨內(nèi)板的細小分支成為了顱骨的滋養(yǎng)動脈,共同構(gòu)成顱針治療腦血管疾病及后遺癥的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

衡量腦缺血再灌注損傷的程度可以通過神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積的大小而定。本實驗研究發(fā)現(xiàn)針刺腦缺血再灌注損傷大鼠矢狀縫頭皮線、冠狀縫頭皮線、人字縫頭皮線后,能夠減小大鼠腦梗死部位面積,改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分,從而減輕大鼠腦缺血再灌注后的損傷,說明顱針對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

腦卒中發(fā)生的一個重要因素就是氧化應(yīng)激。許多研究證實,腦缺血再灌注損傷發(fā)生過程中,活性氧大量聚集,最終引發(fā)氧自由基損傷[15-16]。在生理狀況下,細胞在呼吸過程中會產(chǎn)生一定量的自由基,但這些自由基會很快地被體內(nèi)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等酶類及時分解,因此并不會對機體造成損傷。但在病理情況下(腦缺血再灌注損傷時),由于細胞新陳代謝發(fā)生改變,產(chǎn)生大量氧自由基,超出了細胞內(nèi)各種酶的代謝,生物膜的不飽和脂肪酸受氧自由基攻擊,使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷,導(dǎo)致細胞的死亡或凋亡通路被過度激活,造成不可逆的損傷。有文獻報道,缺血再灌注后腦內(nèi)自由基顯著增加,增加的自由基可能來源于線粒體功能受損后呼吸鏈、胞質(zhì)中NADPH進入線粒體后的氧化等[17-19],因此抗自由基治療是早期腦保護的重要途徑之一。

SOD和MDA是反映自由基損傷的指標(biāo)。SOD屬于細胞內(nèi)源性的抗氧化酶類,在機體的氧化平衡中扮演著重要角色。SOD能清除超氧陰離子自由基,保護細胞抵抗氧化損傷,其活性的強弱反應(yīng)了細胞的抗氧化能力,能間接反映細胞的受損程度。MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化指標(biāo)。自由基能作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),生成MDA,與蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子交聯(lián)聚合,影響線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性,對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用。目前,針對氧化應(yīng)激的干預(yù)措施及藥物研究較多[20-22],但隨著世界老年人口的增多、人民生活水平的提高,預(yù)計腦卒中的發(fā)病率在我國還會繼續(xù)上升,中醫(yī)治療中風(fēng)有著悠久的歷史,積累了豐富的理論知識和臨床經(jīng)驗,特別是針灸療法,是一種常見而有效的治療缺血性中風(fēng)方法,臨床有關(guān)報道頗多[23-26]。

本實驗結(jié)果顯示,大鼠在腦缺血再灌注后,血漿MDA含量升高,血漿SOD活性降低;顱針干預(yù)后,可明顯升高SOD活性,而MDA含量明顯降低。提示顱針對腦缺血再灌注損傷的保護機制與提高機體抗氧化能力,從而減輕由氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),抑制缺血再灌注后氧化應(yīng)激有關(guān)。本實驗研究證實了顱針對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用,初步探討了其可能的作用機制是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激途徑實現(xiàn)其保護作用,更深入具體的作用機制還有待于進一步的研究。

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The Effect of Skull Acupuncture on Oxidative Stress in Rats with Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury

1,2,3,3.

1.351100,; 2.350001,; 3.350122,

Objective To investigate the effect of skull acupuncture on cerebral infarct volume and plasma SOD activity and MDA and NO contents. Method Forty-eight male SPF-grade SD rats were randomized into sham operation, model and skull acupuncture groups. A rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was made by intraluminal thread occlusion. Rat nerve function was assessed by Zea Longa neurological function scoring. Rat cerebral infarct volume was measured by TTC staining. Plasma superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) contents were measured by colorimetry. Result Rat neurobehavioral score was significantly lower on day 1, 3 and 7 in the model group than in the sham operation group (＜0.01). TTC measurement showed that cerebral infarct volume was significantly smaller in the skull acupuncture group than in the model group (＜0.01). Plasma SOD activity was lower and MDA and NO contents were higher in the model group than in the sham operation group (all＜0.01). Plasma SOD activity increased and MDA and NO contents decreased after skull acupuncture treatment compared with the model group (all＜0.01). Conclusion Skull acupuncture has a protective effect against cerebral ischemia/reperfusion injury and can increase plasma SOD activity and decrease plasma MDA and NO contents in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.

Electroacupuncture; Stroke; Cerebral ischemia/reperfusion injury; Oxidative stress; Rats;Head acupuncture Skull acupuncture

1005-0957(2016)12-1473-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.12.1473

福建省教育廳B類課題(JB09127)

黃玉棟(1976 - ),男,主治醫(yī)師, Email:1013012570@qq. com

鄭雪峰(1979 - ),男,副教授,博士,Email:drzxf01@163.com

2016-04-25