紅花多糖對H22荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能的影響

萬亞菲（江蘇省連云港市中醫(yī)院　連云港　222000）

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紅花多糖對H22荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能的影響

萬亞菲（江蘇省連云港市中醫(yī)院連云港222000）

摘要：目的：探討紅花多糖的抗腫瘤作用及其機制。方法：采用移植H22荷瘤小鼠模型，分別設(shè)置陰性對照組、陽性對照組和紅花多糖低、中、高三個劑量組（15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg），對模型小鼠進行效果處理，觀察各組的抑瘤效果、碳廓清能力、耳腫脹度，并對血清GR、GSH-PX、CAT、SOD和MDA含量等進行檢測。結(jié)果：紅花多糖高劑量可明顯抑制小鼠H22實體瘤生長（P＜0.05），抑瘤率為66.8%；高劑量組小鼠血清MDA水平明顯降低（P＜0.05），GR、GSH-PX、CAT、SOD活性較陰性對照組明顯升高，還可降低腫瘤細胞中ROS水平（P＜0.05）。結(jié)論：紅花多糖可明顯增強H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷，從而起到抗腫瘤的作用。

關(guān)鍵詞：紅花多糖H22荷瘤免疫調(diào)節(jié)抗氧化

紅花又稱為草紅花、紅藍花，為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L）的干燥花。紅花性溫、味辛，具有活血通經(jīng)和散瘀止痛之效，其藥用始載于《開寶本草》，至今各版藥典均有收載[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明[2～3]，紅花中的主要成分包括紅花多糖、紅花黃色素、紅花苷、黃酮類、有機酸以及紅花紅色素等，具有抗氧化、抗凝血、降血壓以及抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。另外，紅花在我國各省市、自治區(qū)均有種植，資源豐富，具有藥理毒性低、易于工業(yè)化制備和生產(chǎn)等特點。近年來人們對于紅花的藥用價值尤其是在抗腫瘤等方面的作用的研究越來越深入。在本文中，我們從分子藥理學角度對紅花多糖對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及可能的機制進行研究，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果總結(jié)和報道如下：

1　材料和儀器

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：清潔級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22g，購自南京青龍山動物實驗中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境，恒溫22℃～25℃，（恒濕55±5）%，所有食物與水經(jīng)滅菌處理后使用。

1.1.2實驗材料和儀器：H22荷瘤細胞由江蘇省中醫(yī)院臨床研究所提供；環(huán)磷酰胺購自浙江海正藥業(yè)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒以及2’，7’-一二氯氫化熒光素二脂探針均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；酶標儀、培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.3藥物：紅花多糖為本單位通過水提醇沉法粗提并經(jīng)凍融除雜，再經(jīng)無水乙醇、丙酮、無水乙醚脫化后精制所得，為淡黃色粉末，純度為76.8%，批號為20140301。

1.2實驗方法：將50只小鼠隨機分為5組，分別為：陰性對照組，陽性對照組，紅花多糖低、中、高劑量組，每組10只。在無菌環(huán)境下，取H22荷瘤細胞，以D-Hanks液稀釋成107/mL濃度的瘤細胞液，于每只小鼠右前肢腋部皮下注射0.1mL瘤細胞液。陰性對照組灌服0.9% Nacl溶液，10mL/kg；陽性對照組以環(huán)磷酰胺25mg/kg腹腔注射；紅花多糖給藥組，分別以低、中、高劑量（15mg/kg、45mg/kg和135mg/kg）灌服，給藥頻次均為1次/d。

1.2.1抑瘤作用：荷瘤細胞接種成功的標志為接種5d后，陰性對照組80%的小鼠于腋下長出腫瘤，各組于接種d16后處死動物，對動物體重及腫瘤進行稱重，腫瘤的抑制率=（C-T）/C× 100%，其中C味陰性組腫瘤的平均重量，T為各給藥組腫瘤的平均重量。

1.2.2碳廓清能力測定：于末次給藥后，給小鼠尾靜脈注射印度墨汁（0.1mL/10g），注射后即刻開始計時，分別于注射后2min和10min于眼底靜脈叢取血，迅速以0.1%碳酸鈉溶液稀釋并搖勻，以酶標儀測定各組樣品的OD值。碳廓清指數(shù)K=（logOD1-logOD2）/（T10-T2），OD1和OD2分別為注射印度墨汁后2min 和10min的OD值。

1.2.3遲發(fā)型超敏反應(yīng)耳腫脹度的測定：每只小鼠腹部以硫酸鋇溶液去毛后，以含二硝基氯苯的丙酮橄欖油溶液涂抹腹部致敏，致敏后d7，于右耳內(nèi)外兩面均勻涂抹10μL溶液進行攻擊，24h后將小鼠處死，以打孔器分別于左右耳取直徑7mm的耳片，左右耳片的重量差即為耳腫脹度。

1.2.4抗氧化酶的測定：小鼠于末次給藥后眼球取血，血樣靜置1h后于室溫下以3000rpm離心5min，將血清分離后按照試劑盒中的操作步驟對GR、GSH-PX、CAT、SOD和MDA等指標進行檢測；腫瘤細胞中活性氧（ROS）采用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm。

2　結(jié)果

2.1抑瘤作用：研究結(jié)果顯示，紅花多糖高劑量（135mg/kg）可明顯抑制小鼠H22實體瘤生長，抑瘤率為66.8%，與環(huán)磷酰胺作用相當，與其余各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1　紅花多糖對H22實體瘤的抑制作用（n=10，±s）

表1　紅花多糖對H22實體瘤的抑制作用（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

組別　　劑量（mg/kg）　　腫瘤重量（g）　　抑瘤率（%）陰性對照組陽性對照組低劑量中劑量高劑量-2.23±0.64*0.69±0.31 1.73±0.24*1.30±0.53*0.74±0.47 -25 15 45 135 69.1 22.4*41.7*66.8

2.2免疫調(diào)節(jié)作用及對腫瘤細胞ROS的影響：高劑量組小鼠腫瘤細胞中ROS的含量明顯低于陰性對照組和其余劑量組，碳廓清能力以及對耳廓腫脹的抑制明顯優(yōu)于其余各劑量組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2　紅花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及對腫瘤細胞ROS的影響（n=10，±s）

表2　紅花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及對腫瘤細胞ROS的影響（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

組別　　劑量（mg/kg）耳腫脹度（mg）碳廓清率　ROS（%）陰性對照組陽性對照組低劑量中劑量高劑量-25 15 45 135 5.38±0.86*4.07±0.64 5.42±0.77*5.37±1.03*4.22±0.78 2.51±0.47*2.63±0.55 2.67±0.73*3.12±0.68*4.97±1.12 49.17±5.61*28.52±5.13 37.68±6.12*30.14±4.78*24.77±4.38

2.3對抗氧化酶的影響：紅花多糖高劑量可明顯升高GR、GSHPX、CAT、SOD活性，降低MDA水平，與陰性對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表3。

表3　紅花多糖對抗氧化酶的影響（n=10，±s）

表3　紅花多糖對抗氧化酶的影響（n=10，±s）

*表示與高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

MDA （nmol/ml）陰性對照組　-　 534.2±113.6*631.5±138.7*41.2±3.8*286.3±47.5*5.38±1.12*陽性對照組　25　 476.5±117.4 638.3±112.4 29.4±3.5 268.9±50.4 6.48±0.45低劑量　15　 518.7±99.3*663.8±168.7*40.3±4.1*295.7±40.8*4.63±0.87*中劑量　45　 543.8±133.1*674.1±126.8*48.6±5.3*308.5±50.1*4.28±0.76*高劑量　135　 637.5±124.7 775.2±201.4 61.2±7.1 351.7±46.2 3.58±0.41組別　　劑量（mg/kg）GR （mU/mg）GSH-PX （mU/mg）CAT （u/ml）SOD （u/ml）

3　討論

腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病機制及防治研究一直是我國腫瘤研究的重點，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內(nèi)容之一。研究資料顯示[4～5]，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與人體的機體免疫機能密切相關(guān)，免疫機能下降有利于腫瘤微環(huán)境的發(fā)展，大部分腫瘤患者的免疫力低下；傳統(tǒng)中醫(yī)學理論認為腫瘤的侵襲與患者臟腑功能衰退以及陰陽氣血失調(diào)有關(guān)。中藥多糖作為抗腫瘤的熱門藥物近年來得到越來越廣泛的研究，抗腫瘤作用可通過免疫增強、抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化和凋亡以及直接殺傷腫瘤細胞等多種途徑和環(huán)節(jié)實現(xiàn)。

在本研究中我們以H22荷瘤小鼠模型，研究紅花多糖對腫瘤的抑制作用，并對可能涉及的機制進行探討。結(jié)果顯示，紅花多糖高劑量可明顯抑制腫瘤的生長，抑瘤率與環(huán)磷酰胺相當。紅花多糖高劑量組可明顯升高荷瘤小鼠的碳廓清指數(shù)。碳廓清指數(shù)是體現(xiàn)體內(nèi)巨噬細胞吞噬能力的重要標志，巨噬細胞是機體免疫應(yīng)答中最早對抗原產(chǎn)生反應(yīng)的細胞之一。由此可見，紅花多糖可促進小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高非特異性免疫功能。

自由基可參與體內(nèi)的能量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號的傳遞及部分內(nèi)源性復(fù)合物的形成。有研究顯示[6～7]，若體內(nèi)自由基累積到一定程度，可通過損傷細胞膜中不飽和脂肪酸誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而破壞組織的正常形態(tài)和功能的完整性；ROS可加速機體的氧化損傷，從而促進細胞的衰老，降低免疫力，是體內(nèi)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究的結(jié)果顯示，小鼠灌服高劑量紅花多糖后，血清中GR、GSH-PX、CAT和SOD的活性水平較陰性對照組明顯升高，ROS和MDA水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義。這表明，紅花多糖可在一定程度上抑制ROS產(chǎn)生，減緩機體內(nèi)的SOD消耗，從而起到抗脂質(zhì)過氧化作用。

總之，紅花多糖可明顯增強H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷，從而起到抗腫瘤的作用。

參考文獻

[1]李循，孔繁智，朱婉萍.中藥多糖抗腫瘤作用研究進展[J].浙江中醫(yī)雜志，2006，41（2）：131.

[2]宮汝飛，周丹，馬新博.紅花、柿葉等抗癌中藥藥理研究進展[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2012，33（14）：1915-1916.

[3]梁穎，張曉莉，陶冀，等.紅花多糖對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用[J].中醫(yī)藥學報，2011，39（5）：32-35.

[4]程櫻，張立.中藥抗腫瘤機制及藥物研究進展[J].中國藥業(yè)，2013，22（17）：103-104.

[5]張秀云.抗腫瘤中藥有效部位及化學成分研究進展[J].科技視界，2012，7：177-178.

[6]白巖.槐耳清膏抑制結(jié)腸癌切除后腫瘤復(fù)發(fā)機制探討[J].山東醫(yī)藥，2013，53（38）：34-35.

[7]馬新博，趙鴻鷹，李媛媛，等.紅花多糖對荷S180肉瘤小鼠血清IL-10和IL-12及TNF-α的影響[J].廣東醫(yī)學，2013，34（13）：1984.

Effects of Carthamus tinctorius polysaccharides on the immunity function and antioxidant function of H22 tumor-bearing mice

Abstract：Objective：To observe the effects of Carthamus tinctorius polysaccharides on the immunity function and antioxidant function of H22 tumor-bearing mice. Method：50 H22 tumor-bearing mice were selected and divided into five groups as negative control group，positive group，Carthamus tinctorius polysaccharides groups（15 mg/kg，45 mg/kg and 135 mg/kg）. The model animals were treated and the effects were observed and compared. Results：The high dose of Carthamus tinctorius polysaccharides can obviously inhibit the growth of tumor（P＜0.05），the inhibitory rate was 66.8%. The MDA level of high dose group was significantly decreased（P＜0.05）and the GR，GSH-PX，CAT，SOD activities were increased significantly. Also，ROS in high dose group was decreased（P＜0.05）. Conclusion：Carthamus tinctorius polysaccharides can obviously increase the immunity function of H22 tumor -bearing mice scavenging ROS，alleviate the damage caused by reactive oxygen species which are all benefit for anti-tumor.

Key words：Carthamus tinctorius polysaccharides H22 tumor-bearing mice Immunity function Antioxidation

中圖分類號：R285

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）04-0111-02