一種紅棕色真菌色素穩(wěn)定性的初步研究

陳 鑫，楊解解，薛鵬飛，劉俊林

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）

枸杞（Lycium chincnse Mill）是我國藥食同源，歷史悠久的名貴中藥材。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)枸杞具有多種活性，包括滋補(bǔ)肝腎，預(yù)防腫瘤及動(dòng)脈粥樣硬化等重要藥用功效[1]。內(nèi)生真菌是一類長期潛伏于植物體內(nèi)而不引起植物明顯不適的微生物，內(nèi)生真菌與植物的共生關(guān)系使內(nèi)生真菌能在植物體內(nèi)產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，為色素的開發(fā)利用提供了一種新的研究思路[2]。

天然色素有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥理功能等優(yōu)越性，且相比于其他色素安全性較高，日益受到重視和青睞。真菌色素是微生物色素中研究和應(yīng)用最多的一類色素，特別是某些絲狀真菌是天然色素的重要來源[3]。但天然色素一般穩(wěn)定性較差，對(duì)光、熱、金屬離子、pH、氧化劑等因素非常敏感，色價(jià)會(huì)隨著環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變[4]，色素的穩(wěn)定性決定了其應(yīng)用范圍，可見色素穩(wěn)定性的研究具有非常重要的意義。本試驗(yàn)通過組織塊法、平板劃線法從中藥材枸杞中分離純化得到1株產(chǎn)紅棕色素的菌株（GQ-16-1）[5]，采用固體培養(yǎng)，萃取，離心提取色素，采用比色法、單因子研究法從酸堿度、溫度、金屬離子及氧化劑等方面初步探究枸杞內(nèi)生真菌GQ-16-1所產(chǎn)紅棕色素的穩(wěn)定性[6-9]，旨在為該色素的分離，純化、鑒定與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞內(nèi)生真菌菌株GQ-16-1。由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院細(xì)胞與胚胎工程實(shí)驗(yàn)室、生化與生物制藥實(shí)驗(yàn)室共同分離、保藏的中藥材枸杞內(nèi)生真菌菌株GQ-16-1。

1.1.2 PDA固體培養(yǎng)基。馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，定容至1000mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅棕色素提取與精制。純化菌株，制備真菌GQ-16-1懸液并涂布接種于固體PDA培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基中色素含量飽和，分離菌絲與培養(yǎng)基，棄菌絲保留含色素的培養(yǎng)基，將含有色素的培養(yǎng)基搗碎并浸泡于色素溶解劑（經(jīng)試驗(yàn)，該真菌色素易溶于水）中，料液比為質(zhì)量/體積=1/40，振蕩過夜，離心，得到色素溶液，將色素溶液真空冷凍干燥得到干品色素，4℃保藏。

1.2.2 紅棕色素測試溶液配制。將干品色素溶于蒸餾水中，精確制成濃度為0.001g/mL的測試用色素溶液。

1.2.3 紅棕色素的光譜特性。以溶劑為空白對(duì)照，先用紫外可見分光光度計(jì)在300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm波長下對(duì)色素測試溶液進(jìn)行掃描，測定一個(gè)范圍，再減小波長組距精確掃描，觀察其吸收光譜特性，確定其最大吸收波長λmax。

1.2.4 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。用蒸餾水、NaOH、HCl配置 pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的酸堿試驗(yàn)試劑，分別加入色素測試溶液中（色素測試溶液與酸堿實(shí)驗(yàn)試劑的比值為3∶1），搖勻。將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對(duì)照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同pH值條件下色素溶液的吸光度。

1.2.5 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。取9支試管分別加入5mL 色素測試溶液，標(biāo)記編號(hào) 1、2、3、4、5、6、7、8、9，分別放置于 20、30、40、50、60、70、80、90 和 100℃水浴條件下加熱30min，觀察并記錄溶液顏色，在最大吸收波長下分別測定不同溫度條件下色素溶液的吸光度。

1.2.6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。將含有金屬離子的鹽類（CaSO4、K2CrO7、Na2CrO7、BaSO4、Al2（SO4）3、Cu-SO4、FeCl3、FeCl2、MgCl2）配制成金屬離子濃度為0.2mg/mL的金屬離子實(shí)驗(yàn)試劑。分別把色素測試溶液與各金屬離子實(shí)驗(yàn)試劑混合搖勻（色素測試溶液與金屬離子實(shí)驗(yàn)試劑的比值為3∶1），將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對(duì)照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同金屬離子條件下色素溶液的吸光度。

1.2.7 氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響。將具有氧化性的鹽類（K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃 H2SO4、濃 HCl、濃 HNO3、K2MnO4，NaClO）配置成濃度為0.2mg/mL的氧化劑實(shí)驗(yàn)試劑。分別把色素測試溶液與各氧化劑實(shí)驗(yàn)試劑混合搖勻（色素測試溶液與氧化劑實(shí)驗(yàn)試劑的比值為3∶1），將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對(duì)照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同氧化劑條件下色素溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株固體培養(yǎng)和紅棕色素測試溶液圖

枸杞內(nèi)生真菌菌株GQ-16-1在接種的第3天開始產(chǎn)生紅棕色色素，第10天色素達(dá)到飽和。圖1中真菌GQ-16-1已培養(yǎng)至第10天，色素含量達(dá)飽和，圖2為采用固液萃取，離心提取色素，真空冷凍干燥的提取工藝得到的色素配制而成的色素測試溶液，該色素極易溶于水，其水溶液澄清透明，色澤鮮艷。

圖1 真菌菌株固體培養(yǎng)圖

圖2 紅棕色素測試溶液圖

2.2 紅棕色素的光譜特性

圖3表明，該紅棕色素測試溶液在波長350nm處有最大吸收峰，其吸光度值為1.670。

圖3 色素特征吸收光譜曲線

圖4 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.3 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)紅棕色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖4所示，該圖表明在pH值2～8之間，最大吸收波長下測得的吸光度值上下波動(dòng)，變化不明顯。在pH值9～10之間，色素測定溶液的吸光度值有所增加，溶液顏色加深?？傮w來說，紅棕色素對(duì)pH變化不敏感。

2.4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，在20～100℃之間，吸光度值上下波動(dòng)，變化不明顯。總體來看，試驗(yàn)認(rèn)為該紅棕色素對(duì)溫度變化不敏感。

圖5 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.5 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性影響

由圖6可知，Al3+存在條件下，吸光度值下降，表明Al3+對(duì)該紅棕色素有明顯不良影響。因此，該色素在生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)過程中應(yīng)避免與鋁制品接觸，也可以添加一些螯合劑如EDTA等來消除金屬離子的影響。而Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含 1 種金屬離子）存在條件下，其吸光度值上下波動(dòng)，無明顯變化，對(duì)色素穩(wěn)定性無顯著影響。

2.6 氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖7 氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性影響

圖7表明，強(qiáng)氧化劑NaClO對(duì)紅棕色素測試溶液有明顯增色效果，且無沉淀產(chǎn)生，因此在非食品應(yīng)用的實(shí)際生產(chǎn)中可適量添加NaClO來增加該紅棕色素的色澤。而K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃H2SOA、濃HCl、濃HNO3、K2MnO4（只含1種氧化劑）存在條件下，其吸光度值上下波動(dòng)，對(duì)紅棕色素穩(wěn)定性無顯著影響。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)枸杞內(nèi)生真菌GQ-16-1所產(chǎn)紅棕色素的初步研究，發(fā)現(xiàn)該紅棕色素為水溶性，最大吸光值出現(xiàn)在350nm處，吸光度值為1.670。在pH值2～10穩(wěn)定，偏堿性顏色加深。在溫度為20～100℃穩(wěn)定，說明該色素適用范圍廣，不受溫度限制。金屬離子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含1種金屬離子）對(duì)色素穩(wěn)定性基本無影響，Al3+對(duì)色素穩(wěn)定性有不良影響，因此該色素在應(yīng)用、制備與保存時(shí)都應(yīng)避免與鋁制品接觸。強(qiáng)氧化劑NaClO對(duì)其有明顯增色效果，在K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃 H2SO4、濃 HCl、濃 HNO3、K2MnO4（只含1種氧化劑）中穩(wěn)定存在。

真菌作為一種重要的色素產(chǎn)生菌，在其他研究中早有報(bào)道[10]，如鏈霉菌、三孢布拉霉菌、產(chǎn)紫青霉等，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的這株產(chǎn)紅棕色素菌株是對(duì)產(chǎn)色素菌的進(jìn)一步豐富。試驗(yàn)采用固液萃取，離心提取色素，真空冷凍干燥的提取工藝，不僅簡單易操作，而且提取效率高，不易對(duì)色素本身品質(zhì)造成損害。且溶劑為水，降低成本的同時(shí)也不易造成環(huán)境污染。采用比色法，單因子研究法測試該色素穩(wěn)定性時(shí)，肉眼所見顏色無明顯變化并且吸光度值變化不大則認(rèn)為對(duì)該色素穩(wěn)定性無影響。在研究金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)試劑用鹽類配制，含有其他離子，因此理論上存在誤差。真菌色素使用的最大障礙是毒素的檢測，而本研究未對(duì)色素進(jìn)行毒理性研究，因此其安全性研究還需進(jìn)一步開展。另外，還需研究該色素提取工藝的優(yōu)化及菌株生長條件的優(yōu)化，使其能盡早應(yīng)用于生產(chǎn)。此外，本研究只對(duì)色素穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，該色素的生物學(xué)活性方面有待深入研究，為開發(fā)抗氧化、抑菌、保健等功能色素奠定基礎(chǔ)，提升其應(yīng)用價(jià)值。