海洋低溫α-淀粉酶酶解豌豆淀粉及其生物活性

呂明生，王淑軍，焦豫良，房耀維，劉姝，薛曄敏（.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005；2．淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港222005）

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海洋低溫α-淀粉酶酶解豌豆淀粉及其生物活性

呂明生1，2，王淑軍1，2，焦豫良1，2，房耀維1，2，劉姝1，2，薛曄敏1
（1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005；2．淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港222005）

摘要：豌豆淀粉是一種廣泛用于食品加工的重要的食品原料，采用研制的新型海洋低溫α-淀粉酶，結(jié)合單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的工藝參數(shù)，并對酶解產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，低溫α-淀粉酶酶解豌豆淀粉工藝條件為加酶量35 U/g，時間165min，溫度35℃，豌豆淀粉濃度4%，pH6.5。經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析，酶解產(chǎn)物中麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的總和達(dá)到65.88 %。酶解產(chǎn)物對羥自由基和DPPH自由基均有清除作用，對DPPH自由基的清除效果好于對羥自由基的清除效果。為豌豆淀粉的深入加工提供了參考。

關(guān)鍵詞：低溫α-淀粉酶；豌豆淀粉；酶解；羥自由基；DPPH自由基

低溫酶是指在低溫條件下能有效催化生化反應(yīng)的一類酶，最適反應(yīng)溫度低，在0℃有一定的活性[1]。低溫α-淀粉酶在面團(tuán)發(fā)酵，污水處理，釀造，洗滌劑，食品，紡織和生物燃料生產(chǎn)方面具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用[2]。

目前應(yīng)用的α-淀粉酶主要是中高溫淀粉酶（最適作用溫度約為50℃以上），這些酶只有在較高溫度下才具有較好的催化活性。低溫淀粉酶能節(jié)約能量，降低生產(chǎn)成本，在全世界的需求量逐年劇增，國外研究生產(chǎn)的低溫α-淀粉酶已創(chuàng)造了10億美元的價值[3]，而國內(nèi)低溫淀粉酶的生產(chǎn)還缺乏，有關(guān)低溫淀粉酶的報道尚處于實驗室研究階段。

豌豆是一種以淀粉和蛋白質(zhì)為主的豆料植物，是世界各地廣泛種植的主要食用豆類之一，其產(chǎn)量在豆科類農(nóng)作物中排名第四[4]。豌豆的成熟籽粒中分別含有蛋白質(zhì)21 %～28 %和淀粉48 %～52 %[5]。自然界中的淀粉大多含有80 %的支鏈淀粉和20 %的直鏈淀粉[6]。豌豆淀粉中含直鏈淀粉所占比例較大，光粒豌豆淀粉中含直鏈淀粉33%～50%，皺粒豌豆淀粉中含直鏈淀粉60%～88%[7]。豌豆淀粉用途極廣，既是食品工業(yè)原料，又可直接食用，還可廣泛地用于紡織、輕化、醫(yī)藥等方面[8]。

目前應(yīng)用的α-淀粉酶主要是中高溫淀粉酶（最適作用溫度約為50℃以上），這些酶只有在較高溫度下才具有較好的催化活性。

α-淀粉酶水解麥麩淀粉[9]、番薯淀粉[10]、芭蕉芋淀粉[11]等淀粉，都采用中溫或高溫α-淀粉酶，水解板栗淀粉采用的低溫α-淀粉酶則來自Sigma公司的酶作用溫度為40℃的低溫α-淀粉酶[12]。

本試驗采用自主研制的低溫α-淀粉酶[13]酶解豌豆淀粉，研究酶解條件以及酶解產(chǎn)物的生物特性，以期為豌豆淀粉的深加工提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

海洋低溫ɑ-淀粉酶：實驗室制備；豌豆淀粉：四川友嘉食品有限公司生產(chǎn)；硅膠板：上海信誼儀器廠生產(chǎn)的GF254硅膠板，厚度為0.20 mm～0.25mm。Tris、濃鹽酸、3，5-二硝基水楊酸、無水亞硫酸鈉、苯酚、氯仿、冰醋酸、濃硫酸、正丁醇等試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DPPH：Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；pH儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BS323S型電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器系統(tǒng)有限公司；冷凍離心機(jī)：法國Thermo公司；格蘭仕微波爐：廣東佛山市格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1酶解工藝流程

精確稱取一定質(zhì)量的豌豆淀粉，加水調(diào)成所需濃度的粉漿→加酸或堿調(diào)節(jié)至所需pH→移入恒溫水浴鍋中按要求加入一定量的低溫α-淀粉酶→反應(yīng)一段時間后取出滅酶并冷卻液化液→測定還原糖。

1.3.2還原糖測定方法

用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖[14]。

1.3.3酶解豌豆淀粉工藝的優(yōu)化

單因素試驗：在其他條件相同的情況下，分別研究時間（15、45、75、105、135、165 min）、加酶量（10、15、20、25、30、35 U/g）、溫度（20、25、30、35、40、45℃）、豌豆淀粉（1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %）、pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）5個因素酶解豌豆淀粉的影響。

正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇加酶量、時間、料液比、溫度進(jìn)行四因素三水平L9（34），試驗因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test of the cold-adapted αamylase

1.3.4酶解產(chǎn)物生物活性的分析

1.3.4.1高效液相色譜法（HPLC）

標(biāo)品處理：配等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖，用超純水溶。測高效液相圖譜。樣品處理：加酶量為35 U/g，時間為165 min，豌豆淀粉濃度為4 %，溫度為35℃，取5 mL，測高效液相圖譜。色譜條件：色譜柱為Waters Sugar-Pak1（300 mm×7.8 mm），流動相為水，流速為0.4 mL/min，柱溫為85℃。

1.3.4.2酶解產(chǎn)物對羥自由基（·OH）清除率的測定[15]

取10 mL具塞試管，按順序加入5 mmol/L鄰二氮菲1.5 mL，0.5 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液3 mL，1 mL、7.5 mmol/L的FeSO4，不同濃度酶解液3 mL，1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1 %的H2O2，用重蒸水稀釋到10 mL，37℃保溫60 min，于510 nm處測吸光值（As），空白管（Ab）不加H2O2及酶解液，對照管（Ap）只加H2O2不加酶解液。

1.3.4.3酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率的測定[16]

在比色管中依次加入3.5 mL 6.5 μmol/L DPPH溶液和0.5 mL不同濃度酶解液，混勻20 min后，于517 nm處測定吸光值。用3.5 mL無水乙醇和0.5 mL蒸餾水作為參照，以上各均做3組平行。As為加入樣品的吸光度，Ar為本底吸收的吸光度，A0為空白溶液的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解豌豆淀粉的單因素試驗

2.1.1時間對酶解豌豆淀粉的影響

時間對酶解豌豆淀粉的影響見圖1。

由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)時間從15 min變化為45 min時，還原糖得率有個明顯的上升趨勢，當(dāng)過了45 min后還原糖得率的變化趨于平緩，直至135 min后有了下降的趨勢，后續(xù)試驗的時間選擇135 min。

2.1.2加酶量對酶解豌豆淀粉的影響

加酶量對酶解豌豆淀粉的影響見圖2。

由圖2的總體趨勢可知，加酶量越大，還原糖得率越大。但當(dāng)加酶量超過30 U/g時，還原糖得率有明顯下降的趨勢。即當(dāng)加酶量為30 U/g時，還原糖得率最大并大于50 %。綜合試驗效果和節(jié)約成本考慮，將后續(xù)試驗的加酶量定為30 U/g。

圖1　時間對酶解豌豆淀粉的影響Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis pea starch

圖2　加酶量對酶解豌豆淀粉的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis pea starch

2.1.3溫度對酶解豌豆淀粉的影響

溫度對酶解豌豆淀粉的影響見圖3。

圖3　溫度對酶解豌豆淀粉的影響Fig.3 Effects of temperature on the degree of hydrolysis pea starch

由圖3可知，當(dāng)溫度從20℃變化到35℃時，還原糖得率變化呈平緩上升趨勢，直至35℃時達(dá)到最大值，從試驗效果出發(fā)，后續(xù)試驗的溫度選擇35℃。

2.1.4淀粉濃度對酶解豌豆淀粉的影響

淀粉濃度對酶解豌豆淀粉的影響見圖4。

圖4　淀粉濃度對酶解豌豆淀粉的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis pea starch

由圖4知，當(dāng)?shù)矸蹪舛葟? %增加到4 %時，還原糖得率呈平穩(wěn)上升趨勢，4 %達(dá)到最高點，后續(xù)試驗的豌豆淀粉濃度選擇4 %。

2.1.5 pH對酶解豌豆淀粉的影響

pH對酶解豌豆淀粉的影響見圖5。

圖5　pH對酶解豌豆淀粉的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis pea starch

由圖5可知，pH從5.0變化至6.0，還原糖得率幾乎呈水平變化，直至pH變?yōu)?.5，還原糖得率才有一個較大的變化幅度，而當(dāng)pH繼續(xù)變大，還原糖得率沒有完全上升的趨勢，后續(xù)反應(yīng)的pH選擇6.5。

2.2低溫α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的正交試驗

根據(jù)以上研究結(jié)果，分別選擇加酶量、底物濃度、溫度、pH 4個影響較大的因素，并以各因素的最佳試驗條件為依據(jù)確定其最佳使用范圍，進(jìn)行正交試驗。試驗結(jié)果見表2。

將獲得數(shù)據(jù)用SPSS 17 Statistics軟件進(jìn)行方差分析見表3。

表2　豌豆淀粉正交試驗L9（34）Table 2 Orthogonal experiment of pea starch L9（34）

表3　正交試驗方差分析Table 3 Orthogonal experiment analysis of variance

從表3中可看出，時間（B）對豌豆淀粉的酶解有極其顯著的影響（P<0.01），而加酶量（A）和豌豆淀粉濃度（C）對酶解效果也有顯著影響（P＜0.05）。綜合各種因素，確定豌豆淀粉酶解的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即加酶量為35 U/g，時間為165 min，豌豆淀粉濃度為4 %，溫度為35℃。按最優(yōu)條件進(jìn)行驗證，得到還原糖為81.96 %，通過正交試驗提高了低溫α-淀粉酶對豌豆淀粉的酶解作用。

2.3豌豆淀粉酶解產(chǎn)物分析

2.3.1高效液相色譜法（HPLC）

低聚糖具有促進(jìn)益生菌增殖潤腸通便和降血糖等功能特性，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、飲料、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域[17-18]。低溫α-淀粉酶在最優(yōu)條件下酶解豌豆淀粉，其酶解產(chǎn)物的HPLC結(jié)果顯示（見圖6）。

圖6　酶解產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.6 HPLC of hydrolyzate

由圖6可知，酶解產(chǎn)物有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖，其中麥芽五糖含量最高，根據(jù)峰面積計算，麥芽五糖含量達(dá)到50.56 %，麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的總和達(dá)到65.88 %，這為利用低溫α-淀粉酶對豌豆淀粉進(jìn)行深入加工提供了一定的依據(jù)。

2.3.2酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除率

酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除率見圖7。

圖7　豌豆淀粉酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率Fig.7 Scavenging rate of hydroxyl radical from pea starch

由圖7可知，從曲線走勢來看，隨著豌豆淀粉酶解產(chǎn)物中多糖濃度的增加，羥自由基的清除率呈上升趨勢。酶解產(chǎn)物中多糖濃度越高，對羥自由基的清除效果越好。

2.3.3酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率

酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率見圖8。

圖8　酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of DPPH radical from pea starch

由圖8可知，豌豆淀粉水解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的增加呈上升趨勢。豌豆淀粉酶解液對DPPH自由基的清除率要好于羥自由基率，當(dāng)多糖的濃度為21.58 mg/mL時，此酶解液對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大為20.15 %。

3　結(jié)論

本試驗采用研制的新型海洋低溫α-淀粉酶，結(jié)合單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的工藝參數(shù)，并對酶解產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：低溫α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的最佳工藝條件為加酶量35 U/g，時間165 min，溫度35℃，豌豆淀粉濃度4 %，pH6.5。低溫α-淀粉酶在最優(yōu)條件下酶解豌豆淀粉，其酶解產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果表明酶解產(chǎn)物有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖，其中麥芽五糖含量最高，根據(jù)峰面積計算，麥芽五糖含量達(dá)到50.56 %，麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的總和達(dá)到65.88 %，這為利用低溫α-淀粉酶對豌豆淀粉進(jìn)行深入加工提供了一定的參考。酶解產(chǎn)物對羥自由基和DPPH自由基均有清除作用，羥自由基和DPPH自由基的清除率的高低與水解產(chǎn)物中多糖的濃度的大小呈正比，但對DPPH自由基的清除效果好于對羥自由基的清除效果。

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Hydrolyzate of Pea Starch by Marine Cold-adapted α-Amylase and Its Biological Activity

L譈Ming-sheng1，2，WANG Shu-jun1，2，JIAO Yu-liang1，2，F(xiàn)ANG Yao-wei1，2，LIU Shu1，2，XUE Ye-min1
（1. School of Marine Science and Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang，222005，Jiangsu，China）

Abstract：Pea starch has become an important food ingredient and has been widely used in food processing. Some factors which could influence enzymatic hydrolysis were studied. The optimal conditions of pea starch hydrolysis with the α-amylase：enzyme amount 35 U/g，hydrolysis time 165 min，temperature 35℃，pea starch concentration 4 %，and pH 6.5. The amylase could hydrolyze pea starch into maltose，maltotriose，maltotetraose and maltopentaose by HPLC of analysis. The quantity of maltotriose，maltotetraose and maltopentaose was 65.88 %. The hydrolyzate had the scavenging effect on the hydroxyl radical and DPPH radical. The scavenging effect of DPPH radical was higher than one of hydroxyl radical.

Key words：cold-adapted α-amylase；pea starch；enzymatic hydrolysis；hydroxyl radical；DPPH radical

收稿日期：2015-02-06

作者簡介：呂明生（1963—），男（漢），教授，本科，研究方向：食品生物技術(shù)。

基金項目：國家海洋公益性行業(yè)科研專項（201205020-8）；國家自然科學(xué)基金（31271929）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.024