新疆維吾爾族哮喘與ADAM 33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性研究

胡　昕，米合熱古力·司馬義，崔世紅，王　晶，閆　芳，孫　慧，黃　毅，齊曼古力·吾守爾(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，老年病科，烏魯木齊　80054;昌吉分院，新疆　昌吉　800)

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新疆維吾爾族哮喘與ADAM 33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性研究

胡昕1，米合熱古力·司馬義1，崔世紅1，王晶2，閆芳1，孫慧3，黃毅3，齊曼古力·吾守爾3
(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1呼吸科，2老年病科，烏魯木齊830054;3昌吉分院，新疆昌吉831100)

摘要:目的探討解整合素-金屬蛋白酶33基因(ADAM33)3個(gè)位點(diǎn)(S2、ST+4、ST+5)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族成人支氣管哮喘的相關(guān)性。方法提取206例新疆維吾爾族成人支氣管哮喘患者(哮喘組)與140例新疆維吾爾族成人健康體檢者(對(duì)照組)的血液基因組DNA，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法分析ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，并對(duì)其中部分進(jìn)行基因檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果兩組ADAM33基因S2位點(diǎn)3種基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6．779，P=0．034)，ST+4、ST+5位點(diǎn)3種基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);ADAM33基因ST+4 與ST+5位點(diǎn)存在著弱連鎖不平衡;哮喘組Hap4(CCT)顯著低于對(duì)照組(χ2=4．761，P=0．029)，Hap6(GAT)顯著高于對(duì)照組(χ2=10．012，P=0．002)。結(jié)論ADAM33基因S2、ST+4和ST+5位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族成人支氣管哮喘具有相關(guān)性，在維吾爾族群體中ADAM33基因很可能存在有特異性易感的單體型或保護(hù)性單體型。

關(guān)鍵詞:支氣管哮喘;解整合素-金屬蛋白酶33基因;單核苷酸多態(tài)性

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種常見的異質(zhì)性多基因遺傳的呼吸道疾病，以氣道慢性炎癥和可逆性氣流受限為主要特征。近30年來(lái)其發(fā)病率和死亡率仍呈逐年增加的趨勢(shì)［1］。其發(fā)生、發(fā)展是基因-基因、基因-環(huán)境等共同作用的結(jié)果。解整合素-金屬蛋白酶33基因(ADAM33，a disintegrin and metalloproteinase 33)基因是2002年通過定位克隆獲得的第1個(gè)哮喘易感基因，其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同種族、民族的人群中與哮喘及其相關(guān)表型的關(guān)系不盡相同。本研究采用病例-對(duì)照的研究方法，探討ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)多態(tài)性與維吾爾族哮喘的關(guān)系，為哮喘個(gè)體化治療和預(yù)后提供線索。

1　資料與方法

1．1臨床資料選擇2012年4月－2013年4月經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科門診及住院明確診斷的維吾爾族哮喘患者206例(哮喘組)。選擇同期維吾爾族健康體檢者140例為對(duì)照組。哮喘診斷根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組2008年制定的支氣管哮喘防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。所有研究對(duì)象均為長(zhǎng)期居住在新疆3代或3代以上、1個(gè)月內(nèi)未接受糖皮質(zhì)激素治療者，采集血液樣本前24 h內(nèi)停用支氣管擴(kuò)張藥。同時(shí)，排除合并呼吸衰竭、肺結(jié)核活動(dòng)期、妊娠、心功能≥3級(jí)、肝功轉(zhuǎn)氨酶≥200 U/L、腎功能不全、處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)的患者。哮喘組:男性81例，女性125例，平均年齡(42．89±14．03) 歲;對(duì)照組:男性55例，女性85例，平均年齡(40．22±14．56)歲。兩組年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，具有可比性。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，且所有受試對(duì)象均取得知情同意。

1．2主要實(shí)驗(yàn)儀器PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(加拿大BBI公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)，U-3010紫外-可見分光光度計(jì)(Hitachi公司)。

1．3方法

1．3．1樣本收集與保存分別采集兩組研究對(duì)象的外周靜脈血2 mL，保存于抗凝管中，2 h內(nèi)置于－80℃冰箱中冷凍儲(chǔ)存。

1．3．2基因組DNA提取用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。

1．3．3 PCR擴(kuò)增和SNP-RFLP檢測(cè)步驟(1)PCR反應(yīng)體系:總體系15μL，包括配制板0．5μL、10× Taq buffer 1．5μL、dNTP(2．5 mMeach)0．3μL、上下游引物(50 pmoL/μL)各0．2μL、Tap酶0．1μL、MgCl21．2μL、去離子水11μL(每個(gè)SNP的上下游引物和Tap酶見表1);(2)PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5 min，變性95℃30 s，退火68℃45 s，延伸72℃60 s，20個(gè)循環(huán);每循環(huán)退火溫度降低0．5℃，變性95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s，20個(gè)循環(huán);修復(fù)延伸72℃6 min。(3)酶切體系:PCR反應(yīng)體系10μL，10×Buffer R 1．5μL，酶(10 U/μL)0．1 μL，去離子水3．4μL，37℃溫箱中過夜;酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下凝膠成像儀中觀察結(jié)果并保存分析。(4)DNA序列測(cè)定:將擴(kuò)增好的PCR片段送往上海生工生物工程有限公司行DNA序列測(cè)定。

表1　ADAM 33基因PCR引物序列與擴(kuò)增參數(shù)

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多樣本計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)，組間基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，不同基因型和等位基因?qū)ο南鄬?duì)危險(xiǎn)度用單變量Logistic回歸分析。利用SHEsis軟件進(jìn)行基因連鎖不平衡分析及單體型的構(gòu)建，單體型頻率＜0．03不進(jìn)一步分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1 ADAM 33基因各位點(diǎn)的Hardy-W einberg遺傳平衡定律的檢驗(yàn)按照Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，均為P＞0．05，結(jié)果表明兩組研究樣本的群體代表性好，符合H-W遺傳平衡定律(表2)。

2．2 ADAM 33基因各位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率哮喘組和對(duì)照組ADAM33基因S2位點(diǎn)3種基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，ST+4、ST+ 5位點(diǎn)3種基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。ADAM33基因S2、ST+4、ST+5位點(diǎn)等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)(表3)。

表2　哮喘組和對(duì)照組中ADAM 33基因SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)

2．3 ADAM 33基因各位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果對(duì)兩組的部分研究對(duì)象的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，驗(yàn)證SNP-RFLP檢測(cè)結(jié)果，S2位點(diǎn)檢測(cè)到了G/G、C/G、C/C 3種基因型，G等位基因?yàn)橥蛔兓?ST+ 4位點(diǎn)檢測(cè)到了A/A、A/C、C/C 3種基因型，C等位基因?yàn)橥蛔兓?ST+5位點(diǎn)檢測(cè)到了T/T、C/T、C/ C 3種基因型，T等位基因?yàn)橥蛔兓?。結(jié)果見圖1 ～3。

表3　兩組ADAM33基因3個(gè)SNP基因型與等位基因頻率分布比較/例(%)

圖1　S2位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果

圖2　ST+4位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果

圖3　ST+5位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果

2．4 ADAM 33基因連鎖不平衡分析及單體型的構(gòu)建ADAM33基因ST+4、ST+5位點(diǎn)之間存在著弱連鎖不平衡。S2、ST+4和ST+5位點(diǎn)構(gòu)建的8種單體型頻率的組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 19．098，P=0．004);哮喘組Hap4(CCT)顯著低于對(duì)照組(χ2=4．761，P=0．029)，Hap6(GAT)顯著高于對(duì)照組(χ2=10．012，P=0．002)(表4、5)。

表4　ADAM 33基因多態(tài)位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析

3　討論

的不斷改進(jìn)，哮喘的發(fā)病率不但沒有下降，反而有所升高。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有1．5億哮喘患者，各國(guó)哮喘的患病率為1．0%～13．6%［3］。我國(guó)哮喘的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，因此哮喘的防治早已成為一個(gè)值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。眾多的研究顯示，ADAM33基因參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制，在不同種族、不同民族中表達(dá)不同［4－5］。

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，平喘治療方案

表5　ADAM 33基因多態(tài)單體型在維吾爾族哮喘組和對(duì)照組中的分布/例(%)

維吾爾族是新疆的主體民族之一，人口流動(dòng)性小，與外界通婚較少，其遺傳背景和生活方式較為一致。本研究顯示，維吾爾族人群ADAM33基因S2位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率與漢族、高加索人群有所不同，提示該基因多態(tài)分布具有民族特異性。等位基因S2(G)、ST+4(C)和ST+5(T)位點(diǎn)不增加或減低哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Dijkstra等［6］對(duì)200例哮喘患者進(jìn)行25年的跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)S2多態(tài)位點(diǎn)與第一秒用力呼氣容積的過度下降顯著相關(guān)，與哮喘的發(fā)病及病程均有密切關(guān)系。本研究與遲翔宇等［7］、Awasthi等［8］、de Faria等［9］的研究結(jié)果相似，即S2多態(tài)位點(diǎn)與哮喘的發(fā)病具有相關(guān)性。Awasthi等［8］研究顯示，ST+5多態(tài)位點(diǎn)與兒童哮喘有關(guān)聯(lián)性，與本研究結(jié)果不一致，原因有待深入研究。

本研究對(duì)ADAM33基因3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了連鎖不平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ST+4與ST+5位點(diǎn)存在著弱連鎖不平衡，哮喘組Hap4(CCT)、Hap6(GAT)2種單體型頻率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)在維吾爾族群體中ADAM33基因很可能存在有特異性易感的單體型或保護(hù)性單體型。有待進(jìn)一步地研究ADAM33基因在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及在氣道重塑中的作用機(jī)制。

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(本文編輯楊晨晨)

Association between polymorphism of S2，ST+4，ST+5 locus in ADAM 33 gene and bronchial asthma in Xinjiang Uyghur population

HU Xin1，M ihereguli Simayi1，CUIShihong1，WANG Jing2，YAN Fang1，SUN Hui3，HUANG Yi3，QimanguliW ushouer3
(1Department of Respiratory Medicine，2Department of Geratology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi，830054，China;3Changji Branch Hospital，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Changji831100，China)

Abstract:Objective To investigate the association of the S2，ST+4，ST+5 locus in the ADAM33 gene polymorphism with bronchial asthma of Uygur adult population in Xinjiang．M ethods Extract DNA from 206 Uygur patients with bronchial asthma(asthma group)and 140 Uygur healthy individuals(control group)．PCR－RFLP was used to determine polymorphism of S2，ST+4，ST+5 locus in ADAM 33 gene，in which a part of the samples were chosen for genetic testing．Resu lts The comparison of three genotypes of the S2 in the ADAM 33 had statistical significance in asthma group and control group(χ2=6．779，P=0．034)．But ST+4 and ST+5 had no statistical significance(P＞0．05)．The comparison of allelic frequencies of S2，ST+4，ST+5 locus had no statistical significance(P＞0．05)．There was weak linkagebook=262,ebook=12disequilibrium between ST+4 and ST+5 in ADAM 33 gene;Linkage disequilibrium analysis showed that Hap4(CCT)in asthmatics was much lower than in controls(χ2=4．761，P=0．029)，while Hap6 (GAT)wasmuch higher than in controls(χ2=10．012，P=0．002)．ConclusionThe Polymorphism of the S2，ST+4，and ST+5 locus in the ADAM 33 gene had significant correlation with bronchial asthma of Uygur population of adults in Xinjiang．The susceptible and protective haplotypes of asthmaticsmay exist in Uygur population．

Keywords:bronchial asthma;ADAM33gene;single nucleotide polymorphism

［收稿日期:1015-12-06］

通信作者:齊曼古力·吾守爾，女(維吾爾族)，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:支氣管哮喘的臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)研究，E-mail:qimenw@hotmail．com。

作者簡(jiǎn)介:胡昕(1983－)，女(漢族)，在讀博士，主治醫(yī)師，研究方向:支氣管哮喘的臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81160004，81100026)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．002

中圖分類號(hào)::R562．2+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1009-5551(2016)03-0261-04