PI3K／Akt／mTOR信號通路對自然衰老小鼠骨骼肌自噬的影響及不同運動方式的調控

樊申元，靳二輝

?運動人體科學

PI3K／Akt／mTOR信號通路對自然衰老小鼠骨骼肌自噬的影響及不同運動方式的調控

樊申元1，靳二輝2

（1安徽科技學院體育部，安徽鳳陽233100；2安徽科技學院動物科學學院，安徽鳳陽233100）

目的：探討不同方式運動對自然衰老小鼠骨骼肌自噬的影響及其分子生物學機制。方法：36只8周齡雌性小鼠隨機分為衰老對照組（C）、衰老自主運動組（V）、衰老跑臺運動組（F）。C組于鼠籠中正常飼養(yǎng)，V組和F組分別進行8周的自主跑輪運動和跑臺運動。訓練結束12～24h內，取腓腸肌，利用RT-PCR法檢測相關細胞因子的mRNA表達。結果：與C組相比，V組PI3K（P＜0.05）、PDK1（P＜0.05）和Atg3（P＜0.05）的mRNA表達均出現(xiàn)顯著變化；與C組相比，F(xiàn)組PI3K（P＜0.01）、PDK1（P＜0.01）、Akt（P＜0.05）、mTOR（P＜0.05）、TSC2（P＜0.05）、Atg3（P＜0.01）、ULK1（P＜0.05）、Beclin1（P＜0.05）、LC3（P＜0.05）和Atg7（P＜0.05）mRNA表達均出現(xiàn)顯著變化；與V組相比，F(xiàn)組PI3K（P＜0.05）、PDK1（P＜0.05）、Akt（P＜0.05）的mRNA表達均顯著上調。結論：跑臺運動可通過激活PI3K／Akt／mTOR信號通路抑制衰老小鼠骨骼肌的自噬水平。

不同方式運動；衰老；骨骼??；自噬；PI3K／Akt／mTOR

隨著年齡增加，骨骼肌蛋白質合成能力下降，同時伴隨著分解代謝的加快，造成骨骼肌體積和重量的下降，使得細胞中自噬水平被程序性啟動，并且有研究發(fā)現(xiàn)自噬性程序性細胞死亡可能是衰老過程中骨骼肌體積和質量下降的重要原因之一［1］。而作為自噬發(fā)生過程中的標志基因Beclin1、LC3和Atg7，研究證實，當自噬發(fā)生時Bcl-2、LC3和Atg7表達均出現(xiàn)顯著上調［2］。近來研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）作為一種絲／蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖、分化、細胞周期調控等多個方面起到重要作用。而PI3K／Akt／mTOR信號通路與自噬的激活和發(fā)生存在密切相關［3－4］，但目前有關該信號通路調控衰老骨骼肌自噬發(fā)生的相關研究還較少。運動訓練作為一種重要的干預手段，在自噬激活和發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。但目前有關運動訓練調控衰老骨骼肌自噬的相關研究尚存在爭議。Lira等［5］研究證實，長期有規(guī)律的運動可顯著抑制自噬基因Atg6／Beclin1，Atg7和Atg8／LC3表達下調自噬水平。但David W等［6］研究卻發(fā)現(xiàn)，長時間的自主跑輪運動可顯著抑制衰老大鼠的骨骼肌自噬水平。Kim等［7］在其研究中利用跑臺運動（40 min／d，16.3 m／min，5 d／周，8周，坡度5°）對小鼠進行訓練時亦發(fā)現(xiàn)其可顯著激活衰老小鼠骨骼肌的自噬水平。體育科學或運動醫(yī)學領域內，有關PI3K／Akt／mTOR信號通路調控衰老骨骼肌自噬發(fā)生的相關研究還鮮有報道，其生物學機制尚不清晰。

綜上所述，本研究利用自然衰老小鼠作為動物模型，并利用自主跑輪訓練和跑臺訓練兩種運動方式對自然衰老小鼠進行運動訓練。利用RT-PCR法分別對PI3K／Akt／mTOR信號通路和自噬標志性基因相關細胞因子的mRNA表達進行檢測，探究不同運動方式對自然衰老小鼠骨骼肌細胞自噬水平的影響及其分子生物學機制。

1 研究材料與方法

1.1 實驗動物及分組

36只8周齡雌性C57BL／6小鼠，于2012年9月購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（皖）2007－001。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為：衰老對照組（C）、衰老自主運動組（V）和衰老跑臺訓練組（F）每組，另外6只備用。小鼠在（25± 3）℃溫度下進行飼養(yǎng)，標準小鼠飼料喂養(yǎng)（購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心），自由飲水，每天注意觀察小鼠生活習性，晝夜比為12：12。按此喂養(yǎng)至2014年8月底。

1.3 實驗動物訓練方案

于2014年9月開始，對F組和V組小鼠分別進行跑臺訓練和自主跑輪訓練；C組小鼠在鼠籠中自由活動；S組小鼠進行中等強度跑臺訓練，速度0.8 km／h，45 min／d，6 d／周，共8周。具體安排如下：第1周前3天，20 min／d，后3天30 min／d，第2周開始每天訓練45 min。V組進行自主跑輪運動，共8周。

1.4 實驗動物取材

第8周最后一次訓練結束后12～24 h內，斷頸椎處死小鼠，分離腓腸肌，在預冷的PBS緩沖液中清洗干凈，保存于－80°冰箱中以備RT-PCR檢測自噬相關特異性基因和mTOR信號通路中相關細胞因子的mRNA表達。

1.5 腓腸肌中自噬特異性基因和mTOR信號通路相關細胞因子mRNA表達定量檢測

將保存于－80°冰箱中的腓腸肌組織取出，利用TRIzol法提取腓腸肌組織中的總RNA，按反轉錄試劑盒（購自美國Fermentas公司）步驟和說明，將RNA反轉錄為cDNA。然后利用定量試劑盒（購自美國Fermentas公司）對cDNA中Beclin1、LC3、Atg13和Atg7和PI3K／Akt／mTOR信號通路中相關細胞因子（PI3K、PDK1、Akt、TSC2、mTOR、ATG13、ULK1）mRNA表達進行定量檢測。PCR引物由上海生工合成（表1）。

表1 目標基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用2－△△法對原始數(shù)據(jù)進行分析，各檢測結果均以（ˉX±S）表示，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為顯著性差異標準，以P＜0.01為非常顯著性差異標準。

2 實驗結果

2.1 不同方式運動對自然衰老小鼠骨骼肌PI3K／Akt／mTOR信號通路的影響

由圖1可知，與C組相比，V組PI3K（P＜0.05）和PDK1（P＜0.05）mRNA表達均出現(xiàn)顯著上調；與C組相比，F(xiàn)組PI3K（P＜0.01）、PDK1（P＜0.01）、Akt（P＜0.05）和mTOR（P＜0.05）的mRNA表達均出現(xiàn)顯著上調，TSC2（P＜0.05）mRNA表達出現(xiàn)顯著下調；與V組相比，F(xiàn)組PI3K（P＜0.05）、PDK1（P＜0.05）和Akt（P＜0.05）的mRNA表達均出現(xiàn)顯著上調，mTOR（P＞0.05）隨呈上升趨勢但差異不具有顯著性，TSC2（P＞0.05）mRNA表達呈下調趨勢，但差異不具有顯著性。

圖1 不同方式運動對自然衰老小鼠PI3K／Akt／m TOR信號通路中相關細胞因子表達的影響

2.2 不同方式運動對自然衰老小鼠骨骼肌自噬水平的影響

由圖2可知，與C組相比，V組小鼠骨骼肌中Atg3（P＜0.05）mRNA表達下調且差異具有顯著性，ULK1（P＞0.05）、Beclin1（P＞0.05）、LC3（P＞0.05）和Atg7（P＞0.05）mRNA表達雖下調但差異不具有顯著性；與C組相比，F(xiàn)組小鼠骨骼肌中Atg3（P＜0.01）、ULK1（P＜0.05）、Beclin1（P＜0.05）、LC3（P＜0.05）和Atg7（P＜0.05）mRNA表達均出現(xiàn)顯著下調；與V組相比，F(xiàn)組小鼠骨骼肌中Atg3（P＞0.05）、ULK1（P＞0.05）、Beclin1（P＞0.05）、LC3（P＞0.05）和Atg7（P＞0.05）mRNA表達均下調但差異不具有顯著性。

3 討論與分析

3.1 不同方式運動對衰老小鼠骨骼肌中PI3K／Akt／mTOR信號通路的影響

mTOR參與了體內多條信號通路，其中PI3K／Akt／mTOR信號通路在多種生物學過程，如癌癥發(fā)生、細胞分化、骨骼肌生長、成纖維細胞增殖等發(fā)揮著重要的調控作用。PI3K作為該通路的上游因子，分為Ⅰ和Ⅲ兩種類型（其中Ⅰ型通過激活PI3KAkt，Ⅲ型可與Beclin1結合［8］）。但無論Ⅰ型還是Ⅲ型，最后都是通過作用于mTOR進而發(fā)揮其生物學作用。當PI3K被激活后，其促進PDK1在Thr308位點上的磷酸化，PDK1可激活其下游的Akt蛋白，接著磷酸化下游的TSC2，而TSC2具有GTP酶活化蛋白（GAP）活性，所謂GAPs是指能夠將GTP酶從GTP結合的活化狀態(tài)轉化為GDP結合的非活化狀態(tài)的一類酶，也就是說TSC2可以將Rheb（一種小GTP酶）從活化狀態(tài)轉換成非活化狀態(tài)，從而達到抑制mTOR活性的目的［9］。mTOR被抑制后又可磷酸化自噬基因13（Atg13），其與Atg1分別同ULK1和ULK2相結合，介導ULK1蛋白與FIP200的相互作用。ULK1-Atg13-FIP200復合物是mTOR的直接靶蛋白，也是mTOR通路對某些生物學作用的關鍵調控者。mTOR磷酸化Atg13，使其不能與Atg1結合從而發(fā)揮生物學作用［10］。此外，mTOR活性增強時，通過磷酸化S6K1使其激活，進而磷酸化p70S6來促進mRNA轉移［11］。

圖2 不同方式運動對自然衰老小鼠骨骼肌自噬水平的影響

目前有關PI3K／Akt／mTOR信號通路的研究較多，張雯［12］在其研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt／mTOR信號通路在宮頸癌及肝癌細胞的發(fā)生及細胞增殖過程中具有重要的作用。吳登艷等［13］在研究黃芩苷對異常增生的瘢痕組織時，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路抑制人增生性瘢痕組織成纖維細胞的增殖。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／AKT／mTOR信號通路在組織蛋白酶S誘導的人惡性膠質瘤細胞自噬中具有重要作用。目前有關PI3K／AKT／mTOR信號通路調控相關生物學作用的相關研究較多，但有關其在衰老骨骼肌中表達的相關研究尚未見報道。并且運動訓練作為一種特殊的干預手段，其在激活PI3K／AKT／mTOR信號通路上具有重要的作用。李志剛［15］在其研究中發(fā)現(xiàn)，適宜負荷游泳訓練能誘導PI3K／Akt／mTOR信號蛋白磷酸化表達，促進骨骼肌蛋白合成及肌肉的生長。Bodine［16］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt／mTOR信號通路在抗阻訓練調控出生后骨骼肌體積和質量上具有重要作用。然而目前有關不同方式運動調控衰老組織PI3K／AKT／mTOR信號通路研究還未見報道。本研究中，經過8周運動訓練結束后，自主跑輪組小鼠骨骼肌中只有PI3K和PDK1的mRNA表達上調而其他細胞因子的mRNA表達沒有變化，而跑臺組骨骼肌中PI3K／Akt／mTOR信號通路中各細胞因子的mRNA表達均出現(xiàn)顯著變化。說明與自主跑輪運動相比，跑臺訓練可更好的激活衰老小鼠骨骼肌中的PI3K／Akt／mTOR信號通路，這與Hayasaka等［17］的研究結果相一致，他們研究也發(fā)現(xiàn)跑臺訓練要比自主運動更能激活PI3K／Akt／mTOR信號通路。究其原因，這可能與自主跑輪運動相比，跑臺運動運動強度較大能更好的激活衰老小鼠骨骼肌中胰島素樣生長因子（IGF-1）和BMPs信號通路中的BMP-6高表達密切相關［18］。IGF-1作為PI3K／AKT／mTOR信號通路的上游啟動生長因子，運動訓練可通過激活IGF-1進而激活PI3K／AKT／mTOR信號通路［19］。而表達上調的BMP-6可通過磷酸化Smad2／3進而上調其下游的靶基因Talin，而表達上調的Talin可促進FAK蛋白表達進而激活PI3K／AKT／mTOR信號通路［20］。再者，還可能與運動訓練可上調人高機動組蛋白A2（HMGA2）有關，因為Yu等［21］在研究細胞衰老時，證實高表達的HMGA2可通過上調cyclin E和CDC25A以及降低蛋白酶抑制因子表達從而激活PI3K／AKT／mTOR信號通路。目前有關運動訓練調控衰老骨骼肌中PI3K／AKT／mTOR信號通路相關研究較少，其生物學機制尚不是很清晰。

3.2 不同方式運動對衰老小鼠骨骼肌自噬水平的影響

骨骼肌作為人體的重要組織器官，在衰老過程中伴隨著骨骼肌體積減小、機能下降等癥狀。近來研究發(fā)現(xiàn)，自噬引起的自噬性程序性死亡是引起衰老小鼠骨骼肌減少及功能下降的重要原因之一［22］。Cao等［23］在其研究中亦發(fā)現(xiàn)，自噬水平的升高與衰老小鼠骨骼肌萎縮、力量下降等存在密切相關。而在調控自噬發(fā)生的特異性基因標志物中，Beclin1在自噬發(fā)生過程中起著正調控作用，是首個被鑒定可調控哺乳動物自噬水平的關鍵基因，參與細胞自噬的發(fā)生［24］。Atg13、ULK1和LC3（Atg8）參與自噬體形成過程中兩大泛素系統(tǒng)，是細胞自噬的通用標志物［25］。Atg7作為肌肉自體吞噬另一個關鍵的特異性基因，是自噬體伸展擴張過程中的重要標志物，可導致肌肉萎縮和衰老引起的肌肉力量下降［26］。目前有關衰老引起骨骼肌自噬水平升高的研究較多，Wohlgemuth等［27］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠24個月后骨骼肌出現(xiàn)顯著的衰老癥狀并且骨骼肌中的自噬標志基因Atg13、ULK1、Beclin1、LC3和LAMP-2等基因表達均出現(xiàn)顯著上調。Leeuwenburgh等［28］研究也證實，衰老小鼠骨骼肌中調控自噬發(fā)生的關鍵性細胞因子——Beclin1、Atg7和LC3等均顯著上調。而運動訓練作為一種特殊的調控衰老骨骼肌自噬發(fā)生的重要手段，Lira等［5］研究發(fā)現(xiàn)，大強度的跑臺訓練可顯著上調衰老小鼠骨骼肌中Atg13、ULK1、LC3等自噬標志基因的表達，促進自噬的發(fā)生，而自主跑輪運動可下調衰老小鼠骨骼肌的自噬水平但作用效果不是很顯著。Kim等［7］研究也發(fā)現(xiàn)，8周的中等強度上坡跑訓練可顯著下調衰老ICR小鼠骨骼肌中Atg13、Beclin1、Atg7和LC3的基因表達，抑制自噬的發(fā)生。Chistiakov等［29］研究發(fā)現(xiàn)，8周游泳訓練對于下調衰老C57BL／6小鼠股四頭肌自噬水平的作用并不是很明顯。本研究中，與對照組相比，V組只有Atg13顯著下調，而F組的Atg13、ULK1、Beclin1、LC3和Atg7自噬標志基因均顯著下調。說明，跑臺運動抑制衰老小鼠自噬發(fā)生的作用效果優(yōu)于自主跑輪運動。這與Lira等的研究結果不一致，他們研究發(fā)現(xiàn)大強度跑臺訓練上調衰老小鼠骨骼肌的自噬水平。究其原因，這可能與Lira等［5］的研究中采用的運動強度較大有關。運動強度較大時，肌肉組織受到較大的損傷，導致自噬水平的提高［30］。跑臺訓練抑制衰老小鼠骨骼肌自噬水平的效果優(yōu)于自主跑輪運動，這與本研究中跑臺訓練可激活PI3K／AKT／mTOR信號通路密切相關。因為Zhao等［31］研究證實，激活PI3K／AKT／mTOR信號通路后可抑制自噬的發(fā)生，使得Atg13、Beclin1、LC3、Atg7等自噬標志基因表達顯著下調。再者可能與跑臺訓練可激活LKB1-AMPK信號通路有關［32］，LKB1激活后可上調AMPK的表達，并進一步磷酸化mTOR從而抑制衰老小鼠骨骼肌的自噬水平，使得LC3、Beclin1等自噬標志基因表達下調，自噬泡數(shù)量降低［33］。跑臺訓練可更好的抑制衰老小鼠骨骼肌自噬的發(fā)生，還可能與其可更好的抑制Omi／Hax1信號通路進而抑制自噬發(fā)生有關［34］。

4 結論

跑臺運動可通過激活PI3K／Akt／mTOR信號通路，從而抑制衰老小鼠骨骼肌的自噬水平。

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責任編輯：郭長壽

Effect of Different Exercise M odes on Autophagy of M uscles in Aging Fem ale M ice Through the PI3K／AKT／m TOR Pathway

FAN Shenyuan1，JIN Erhui2
（1.Physical Education Department，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，Anhui，China；2.College of Animal Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，Anhui，China）

Objective：Research the influence of different exercisemodes on autophagy ofmuscles in aging femalem ice and the biology mechanism.M ethods：36 8-w eek old female C57BL／6 m ice were random ly divided into three groups：aging control group（C），aging voluntary wheel running group（V）and aging treadmill running group（F）.After one week，group V and group F respectively did voluntary wheel training and treadm ill training.A fter 12h of the last training，using themothod of RT-PCR to detect themRNA expression of related gene in the gastrocnemiusmuscles.Results：Compared to group C，themRNA expression of PI3K（P＜0.05），PDK1（P＜0.05）and Atg3（P＜0.05）of group V w ere significantly up-regulated.Compared to group C，themRNA expression of PI3K（P＜0.01），PDK1（P＜0.01），Akt（P＜0.05），m TOR1（P＜0.05），TSC2（P＜0.05）、Atg13（P＜0.05）and ULK1（P＜0.05）of group Fwere significantly upregulated and the expression ofmRNA of Beclin1（P＜0.05）and Atg7（P＜0.05）significantly down-regulated.Compared to group C，the expression of mRNA of PI3K（P＜0.01），PDK1（P＜0.01），Akt（P＜0.05），m TOR1（P＜0.05），ATG13（P＜0.01），ULK1（P＜0.05），Beclin1（P＜0.05），LC3（P＜0.05）and Atg7（P＜0.05）were all significantly changed.Compared to group V，the mRNA expression of PI3K（P＜0.05）、PDK1（P＜0.05）and Akt（P＜0.05）w ere all significantly up-regulated.Conclusion：Treadm ill training can restrain the autophagy level of the agingm ice muscles through activating the PI3K／Akt／m TOR signaling pathway.

exercise of differentmodes；aging；skeletalmuscle；autophagy；PI3K／Akt／mTOR

G804.7

A

1004－0560（2016）01－0082－05

2015-09-23；

2015-11-13

國家自然科學基金（課題編號：31402154）。

樊申元（1980—），男，講師，碩士，主要研究方向為運動與健康。