大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型研究

賀佐梅，黃飛娟，周小青，吳正治，，4，5*，謝夢(mèng)洲,2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科，湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410007；2.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙410007;3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東深圳518033；4.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳518035；5.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東深圳518020）

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大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型研究

賀佐梅1，黃飛娟3，周小青1，吳正治1，3，4，5*，謝夢(mèng)洲1,2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科，湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410007；2.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙410007;3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東深圳518033；4.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳518035；5.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東深圳518020）

〔摘要〕目的研究建立大腸癌（colorectal cancer，CRC)）唾液蛋白質(zhì)指紋圖譜新型分子診斷模型。方法采集34例腸癌患者、45例健康志愿者（正常組）的唾液標(biāo)本，用弱陽(yáng)離子交換型（WCX）納米磁珠聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，獲得各標(biāo)本的蛋白指紋圖譜。用Biomarker Wizard軟件分析所獲得的蛋白指紋圖譜找出差異蛋白，再用Biomarker Patterns 5.0.2建立鑒別診斷模型。結(jié)果共檢測(cè)到312個(gè)腸癌差異蛋白質(zhì)峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對(duì)照＞3，或者正常對(duì)照/腸癌＞3），其中有37個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中有7個(gè)差異蛋白質(zhì)峰腸癌組表達(dá)上調(diào)，28個(gè)差異蛋白質(zhì)峰腸癌組表達(dá)下調(diào)，有35個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有顯著差異（P＜0.01）。篩選建立了由m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39的3個(gè)差異蛋白峰組成的腸癌與正常組的診斷模型，該模型的靈敏度和特異度分別為88％（30/34）和98 ％ (44/45)；通過(guò)交叉驗(yàn)證法進(jìn)一步驗(yàn)證診斷模型的可靠性，結(jié)果該模型的靈敏度和特異度分別為85％ (29/34)和88％ (37/45)。結(jié)論用WCX結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)建立的唾液蛋白診斷模型為腸癌的診斷提供了新途徑。

〔關(guān)鍵詞〕大腸癌；唾液；蛋白質(zhì)組；分子診斷模型；蛋白指紋圖譜；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

大腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)男性和女性第三個(gè)常見的癌癥[1]，是胃腸道常見的惡性腫瘤，以41-65歲發(fā)病率最高[2]。腸癌如果早期發(fā)現(xiàn)5年生存率可達(dá)90％，而有轉(zhuǎn)移的進(jìn)展期大腸癌其5年生存率低于10％[3]。

內(nèi)窺鏡檢查仍然是大腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然內(nèi)鏡設(shè)備得到了一次次升級(jí)變革，從傳統(tǒng)的全結(jié)腸電子內(nèi)鏡到放大內(nèi)鏡及染色內(nèi)鏡、窄帶內(nèi)鏡(NBI)、自發(fā)熒光內(nèi)鏡(AFE)、共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(CEM)、超聲內(nèi)鏡(EUS)、結(jié)腸膠囊內(nèi)鏡(CCE)[4]等各項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)在內(nèi)鏡中的應(yīng)用，提高了分辨率，但仍然價(jià)格昂貴且對(duì)人體傷害較大，嚴(yán)重限制了大腸癌的早期診斷[5]。而新近發(fā)展起來(lái)的大腸癌腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)準(zhǔn)確率低，多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢驗(yàn)雖可一定程度上提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但結(jié)果的準(zhǔn)確性（＜70％）仍不能滿足臨床診斷腸癌需要，且血液檢測(cè)亦為有創(chuàng)檢測(cè)[6]。目前為止還沒有一個(gè)快速、準(zhǔn)確而又適合于大規(guī)模篩查的大腸癌早期診斷方法，因此，尋求一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確率高的無(wú)創(chuàng)傷檢查新方法勢(shì)在必行。

因此，本研究選用大腸癌患者唾液標(biāo)本，運(yùn)用弱陽(yáng)離子交換型（WCX）納米磁珠芯片聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)，擬從唾液蛋白質(zhì)組學(xué)變化探索腸癌的分子基礎(chǔ)并建立分子診斷模型。

1臨床資料

1.1病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)大腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)：有明確的腸鏡下活檢病理和手術(shù)病理學(xué)確診的大腸癌[7]。

健康人標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病史、查體、常規(guī)心電圖、超聲心動(dòng)圖、常規(guī)生化檢查未發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病者[8]。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合診斷標(biāo)準(zhǔn)而且未經(jīng)手術(shù)和放化療；（2）年齡在20-75歲之間；（3）自愿且能夠配合參加的受試對(duì)象。以上3項(xiàng)必須全部符合才能納入。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)（1）不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（2）年齡＜20或＞75歲者；（3）患有口腔局部及唾液腺的炎癥、消化道潰瘍、腫瘤及先天性疾??；患有舍格倫綜合征、囊性纖維??；患有其他系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)疾病。1.1.4質(zhì)量控制（1）釆用統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一調(diào)查表格、統(tǒng)一調(diào)查方法；（2）調(diào)査者在調(diào)査時(shí)嚴(yán)格按照“標(biāo)準(zhǔn)化”執(zhí)行,減少調(diào)查者偏倚,確保資料的一致性和真實(shí)性；（3）電子胃鏡及病理結(jié)果均由1月內(nèi)三級(jí)甲等醫(yī)院診斷。

1.2病例來(lái)源

本研究共納入2014年12月-2015年04月在湖南省腫瘤醫(yī)院腸癌組患者34例，其中直腸癌20例，結(jié)腸癌13例，結(jié)直腸癌1例；男22例、女12例；年齡26～74歲，中位年齡58歲。正常對(duì)照組45 例,男28例、女17例；年齡23～72歲，中位年齡52歲，均來(lái)自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢科健康自愿者。所有病例均按照納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行納入。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1主要儀器和試劑

蛋白指紋圖譜（液體芯片）試劑盒（WCX磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂解液）及MALDITOF-MS（蛋白指紋圖譜儀I型），均為湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，試劑盒批號(hào)為K20150501；dH2O（HPLC級(jí)）、CHCA為Sigma公司產(chǎn)品。

2.2樣品收集與預(yù)處理

按照本課題專用臨床觀察表進(jìn)行臨床觀察記錄。取材前一天晚上臨睡前清水漱口三次（不再進(jìn)任何食物和藥物），采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起漱口前空腹取材。由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的課題組專人取材,前5 min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，患者將已經(jīng)過(guò)消毒的無(wú)菌小圓柱形棉花含入口中，口腔唾液積聚至一定量后，將該棉花吐入置于冰浴中的15 mL唾液離心管內(nèi)，4℃下靜置1 h后，3 000 r/min、4℃下離心10 min，冰浴上分裝在1 mLEP管中，每管200 μL，于-80℃冰箱冷凍保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出樣本，冰上解凍，所有檢測(cè)唾液樣本均一次凍融。取5 μL唾液加入10 μL U9裂解液，混合孵育30 min后，加入185 μL Wash Buffer稀釋（唾液最終上樣量為2.5 μL）。

2.3納米磁珠預(yù)處理、上樣和洗脫

（1）取WCX納米磁珠50 μL加入到200 μLPCR管，置于磁鐵上孵育1 min（注意避免由于孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致磁珠結(jié)塊），去除上清液；（2）再依次加入100 μL Wash Buffer洗脫5 min，在磁鐵上孵育1 min，去除上清液；再重復(fù)操作本項(xiàng)步驟一次；（3）向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中加入100 μL處理好的唾液樣品，混勻后，置于室溫孵育30 min，將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，去除上清液；（4）每管加入100 μL Wash Buffer洗脫5 min，然后將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，去除上清液；再重復(fù)操作本項(xiàng)步驟一次；（5）在PCR管中加入10 μL E-lution Buffer洗脫5 min（不能少于5 min），將PCR管置于磁鐵上孵育1 min，取5 μL上清液移至另一個(gè)PCR管中；（6）裝有5 μL上清液的PCR管中加入5 μL CHCA（基質(zhì)）飽和溶液，充分混勻（混合到樣品顏色發(fā)灰，而沒有明顯的沉淀并及時(shí)上樣），取2 μL混合溶液（1 μL唾液樣品+1 μL基質(zhì)）加樣到Au/Steel芯片上，待干后放入儀器讀取。

2.4芯片檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集和參數(shù)設(shè)置

采用MALDI-TOF MS讀取芯片信息。設(shè)置激光強(qiáng)度為190，靈敏度為5，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比（m/z）范圍為2 000～25 000 m/z，優(yōu)化范圍為2 000 ～15 000 m/z，信號(hào)收集位置40～60，平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次。已知多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片標(biāo)準(zhǔn)（all-in-one），激光離子流0.5.用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度（蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）。

2.5數(shù)據(jù)分析

對(duì)位于2 000～25 000 m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件過(guò)濾噪音。設(shè)置初始的噪音過(guò)濾值為5，二次信噪比為2，以10％為最小閾值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢驗(yàn)比較2組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由Biomarker Wizard軟件完成），找出2組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰。用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計(jì)算出多個(gè)變量（m/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰）變化對(duì)兩樣本的判別價(jià)值，確定最佳的篩選模型（即診斷模型）。

3結(jié)果

3.1數(shù)據(jù)分析及建立診斷模型

腸癌組、正常對(duì)照組兩組共79份唾液標(biāo)本，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后，在相對(duì)分子質(zhì)量為2 000～25 000 m/z范圍內(nèi)共檢測(cè)到312個(gè)蛋白質(zhì)峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對(duì)照＞3，或者正常對(duì)照/腸癌＞3），其中有37個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1），28個(gè)差異蛋白質(zhì)峰表達(dá)下調(diào)（典型下調(diào)對(duì)比圖譜，圖1-A、圖1-B），其中有7個(gè)差異蛋白質(zhì)峰表達(dá)上調(diào)（典型上調(diào)對(duì)比圖譜，圖1-C），有35個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有顯著差異（P＜0.01）。

圖1　-A：m/z為2501的峰，上第1、2幅圖為腸癌組，下第3、4幅圖為正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組相比，腸癌組表達(dá)下調(diào)?？v坐標(biāo)為峰強(qiáng)度（蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）。圖1　-B：m/z為3140的峰,上第1、2幅圖為腸癌組，下第3、4幅圖為正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組相比，腸癌組表達(dá)下調(diào)?？v坐標(biāo)為峰強(qiáng)度（蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）。圖1　-C：m/z為4779的峰,上第1、2幅圖為正常對(duì)照組，下第3、4幅圖為腸癌組。與正常對(duì)照組相比，腸癌組表達(dá)上調(diào)?？v坐標(biāo)為峰強(qiáng)度（蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）。圖1　腸癌組與正常對(duì)照組MALDI質(zhì)譜峰圖

用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計(jì)算出多個(gè)變量（m/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰）變化對(duì)兩樣本的判別價(jià)值，確定最佳的篩選模型（圖2），最終選定m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39建立大腸癌與正常對(duì)照組的判別模型，該模型的靈敏度和特異度分別為88％（30/34）和98％(44/45)（表2）。

圖2　2 501.26、4 779.95和3 140.39三個(gè)差異峰組成的診斷模型

表1　腸癌組與正常組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰

當(dāng)滿足條件以下條件之一者：①2 501.26 m/ z≤14.31且4 779.95 m/z＞8.82；②2 501.26 m/z≤14.31且4 779.95 m/z≤8.82、3 140.39 m/z≤3.09，提示為大腸癌標(biāo)本；當(dāng)滿足條件以下條件之一者：①14.31且4 779.95 m/z≤8.82、3 140.39 m/z＞3.09，提示為正常標(biāo)本。M：質(zhì)譜峰相對(duì)強(qiáng)度。

表2　所建診斷模型對(duì)腸癌的診斷效率（臨床回顧檢驗(yàn)結(jié)果）

3.2診斷模型十字交叉驗(yàn)證

對(duì)所建立的大腸癌診斷模型采用十字交叉法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果該模型的靈敏度和特異度分別為85％ (29/34)和88％(37/45)（表3）。十字交叉驗(yàn)證的ROC曲線值為0.958（圖3-A、圖3-B），進(jìn)一步的分析驗(yàn)證了所建立模型的準(zhǔn)確性。

表3　所建診斷模型對(duì)腸癌的診斷效率（十字交叉驗(yàn)證結(jié)果）

圖3　-A，腸癌組十字交叉驗(yàn)證的敏感性、特異性及ROC曲線。橫軸坐標(biāo)為假陽(yáng)性率(1-特異度)，縱坐標(biāo)為真陽(yáng)性率(靈敏度)。圖3　-B，正常對(duì)照組十字交叉驗(yàn)證的敏感性、特異性及ROC曲線。橫軸坐標(biāo)為假陽(yáng)性率(1-特異度)，縱坐標(biāo)為真陽(yáng)性率(靈敏度)。圖3　腸癌組與正常對(duì)照組的鑒別診斷模型十字交叉驗(yàn)證的ROC曲線

4討論

結(jié)直腸癌是常見腫瘤之一，肝臟是結(jié)直腸癌最常見、最易發(fā)生的轉(zhuǎn)移器官[9]，然而結(jié)直腸癌的早期診斷、與腸良性病變的鑒別以及判斷是否發(fā)生轉(zhuǎn)移尚缺乏有效手段。目前蛋白指紋圖譜技術(shù)在腸癌的研究主要有：大腸癌與正常人的鑒別診斷、大腸癌無(wú)轉(zhuǎn)移與大腸癌肝轉(zhuǎn)移（同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移/異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移）的鑒別、大腸良性病變與大腸癌鑒別，以及大腸癌預(yù)后模型等。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行大腸癌研究，各研究者均得到敏感性、特異性、準(zhǔn)確性較高的分子診斷模型，然而，各研究者所篩選得到的差異蛋白質(zhì)峰差異很大。大腸癌與正常對(duì)照組的差異蛋白對(duì)比研究，柳俊剛等[10 ]發(fā)現(xiàn)m/z為3 223.43、7 971.57、11 493.00；崔丹瑜等[11]發(fā)現(xiàn)m/z為5 909、5 341、2 685、2 811、3 928、6 635、8 933；林建軍等[12]發(fā)現(xiàn)m/z為2 870.7、3 084.0、9 180.5、13 748.8；張巍等[13]發(fā)現(xiàn)為2 974、3 282、5 948、2 957、2 982、5 920、6 647、6 661；Liao CC等[14]發(fā)現(xiàn)1 800～16 000 Da范圍內(nèi)的73個(gè)峰；Xu W[15]發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異蛋白（2 900～9 000 Da）；周智勇等[16]發(fā)現(xiàn)26個(gè)下調(diào)蛋白、52個(gè)上調(diào)蛋白，范圍在4 000 Da～1 110 Da。大腸癌無(wú)轉(zhuǎn)移與肝轉(zhuǎn)移的差異蛋白對(duì)比研究，柳俊剛等發(fā)現(xiàn)m/z為3 223.43、3 511.88、8 894.49；崔丹瑜等發(fā)現(xiàn)在肝轉(zhuǎn)移組m/z為7 570、7 795、7 939、8 137、8 925、9 196、11 814、7 837低表達(dá)，而m/z為5 813蛋白點(diǎn)高表達(dá)。腸良性病變與大腸癌差異蛋白對(duì)比研究，Xu W等發(fā)現(xiàn)m/z為3 570、3 101、4 869在腺瘤組高表達(dá)，在大腸癌組低表達(dá)；張巍等發(fā)現(xiàn)m/z為3 016、66 172個(gè)蛋白點(diǎn)在兩組比較中差異顯著。李小瓊等[17]對(duì)正常組、良性病變組以及（術(shù)前）組三者的差異蛋白研究發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異點(diǎn)，m/z分別為4 955、5 325、5 890、6 615、7 739、8 109、8 575。于新哲等[18]發(fā)現(xiàn)，.結(jié)直腸癌無(wú)轉(zhuǎn)移對(duì)比結(jié)直腸癌異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組,得到0個(gè)差異蛋白峰,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；結(jié)直腸癌異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組對(duì)比同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移組,得到1個(gè)差異蛋白峰,m/z=4 355.26（P＜0.05）；由此可見，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性不足，可能與實(shí)驗(yàn)中樣品的預(yù)處理方法（芯片的種類、廠家、批號(hào)等）、試驗(yàn)操作者技能水平、研究者所采取的質(zhì)譜方法（MALDI、SELDI或其他）、數(shù)據(jù)分析方法（SVM、留一法等）等不一致有關(guān)。

現(xiàn)有研究多針對(duì)腸癌患者血液標(biāo)本或者組織標(biāo)本的有創(chuàng)檢測(cè)，受試者依從性差，不利于反復(fù)采樣、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以及人群盲篩推廣，具有一定的限制性，不能廣泛應(yīng)用。筆者從無(wú)創(chuàng)角度，采用唾液樣本進(jìn)行腸癌的診斷研究，擬取得腸癌早期、無(wú)創(chuàng)診斷新方法。唾液取樣是一種快速、無(wú)創(chuàng)、安全、無(wú)痛苦的過(guò)程，唾液中大量物質(zhì)能夠很好地反映人體全身狀態(tài)，是一種生物全息律的具體表現(xiàn)之一。唾液檢測(cè)可用于自身免疫系統(tǒng)疾病[19]、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病[20]、心理學(xué)研究[21]等各系統(tǒng)疾病的診斷、療效監(jiān)測(cè)及病情進(jìn)展的研究，尤其在各系統(tǒng)腫瘤的研究頗多。研究發(fā)現(xiàn)大腸癌疾病與唾液中的B型內(nèi)皮素受體（endothelin receptor type B，EDNRB）量有關(guān)聯(lián)[22]。因而，本課題設(shè)想可通過(guò)唾液中的特異生物標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)大腸癌的無(wú)創(chuàng)診斷。吳正治[23]等將唾液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)運(yùn)用于中醫(yī)舌苔原理與微觀辨證學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)不同舌苔與唾液蛋白質(zhì)組具有相關(guān)性,并認(rèn)為舌苔原理研究的進(jìn)一步突破，有賴于以分子整體觀為基礎(chǔ)的技術(shù)方法學(xué)的突破。唾液由唾液腺產(chǎn)生，是消化系統(tǒng)的重要組成部分。“脾在液為涎，腎在液為唾”，因而中醫(yī)認(rèn)為唾液與脾腎密切相關(guān)，尤其是與脾胃密切相關(guān)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的表達(dá)者，而中醫(yī)病證各階段必有蛋白質(zhì)為物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，推斷唾液中的某些生物標(biāo)志物（蛋白質(zhì)）能夠有助于中醫(yī)脾胃系統(tǒng)病證診斷的研究[24]。

本實(shí)驗(yàn)將WCX與MALDI-TOF-MS技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步探索腸癌患者唾液差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)了312個(gè)腸癌差異蛋白質(zhì)峰，兩組比值大于3（腸癌/正常對(duì)照＞3，或者正常對(duì)照/腸癌＞3），其中有37個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中有7個(gè)差異蛋白質(zhì)峰腸癌表達(dá)上調(diào)，28個(gè)差異蛋白質(zhì)峰腸癌表達(dá)下調(diào)，有35個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有顯著差異（P＜0.01）。選取m/z為2 501.26、4 779.95、3 140.39建立腸癌組與正常對(duì)照組的判別模型，該模型的靈敏度（88％）和特異度（98％）均高，采用十字交叉驗(yàn)證，靈敏度和特異度分別為85％、88％，可見，該模型對(duì)腸癌的診斷具有一定的價(jià)值。

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（本文編輯李杰）

Establishment of Saliva Protein Fingerprint Molecular Diagnostic Models for Screening Colorectal Cancer

HE Zuomei1, HUANG Feijuan3, ZHOU Xiaoqing1, WU Zhengzhi1,3,4,5*，XIE Mengzhou1,2*
（1. National Key Descipline of TCM Diagnosis, 2011 Collaborative Innovation Center of Digital Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan 410007, China; 2.Hunan Engineering Research Center for the Technology of Creation & Mannufacture of Chinese Medicine for Anti-tumor, Changsha Hunan 410007, China; 3. Futian Affiliated Hospital of Guangdong Medical Institute, Shenzhen, Guangdong 518033, China; 4.The Fist Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen, Guangdong 518035, China; 5.Shenzhen Institute of Geriatrics, Shenzhen, Guangdong 518020, China）

Abstract〔〕Objective To establish a novel molecular diagnostic model of saliva protein fingerprint in colorectal cancer (CRC) patients. Methods Saliva samples from 34 patients with CRC, and 45 healthy people were analyzed by weak cationicexchange magnetic beads (MB-WCX) and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF -MS) methods. Subsequently, we compared the saliva peptide signatures of the two groups and obtained differently expressed peptides by using of Biomarker Wizard, then establish a diagnostic model to diagnose gastric carcinoma by using of Biomarker Patterns 5.0.2. Results 312 differentially expressed protein peaks were detected, the ratio of two groups>3.0 (CRC/control>3.0, or control/ CRC>3.0), including 37 protein peaks were statistically significant (P<0.05); 7 peaks were upregulated, 28 peaks were down -regulated, there were 35 different protein peaks have significant difference (P <0.01). Further more, we screened and built a saliva proteomic models with 3 protein molecules m/z 2501.26, 4779.95, 3140.39book=20,ebook=23to distinguish CRC groups and normal groups. The sensitivity of this model was 88％ (30/34), and the specificity was 98 ％ (44/45). The reliability of this model was further verified with a sensitivity of 85％ (29/34) and a specificity of 88％ (37/45) by cross validation method. Conclusion Saliva proteomic profiling by using MALDI-TOF-MS combined with WCX technique is a novel potential tool for the clinical diagnosis of CRC.

Keywords〔〕colorectal cancer; saliva; proteome; molecular diagnostic model; protein fingerprint; matrix -assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry

〔通訊作者〕*吳正治，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail: szwzz001@163.com。謝夢(mèng)洲，女，博士，研究生，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: xiemz64@qq.com。

〔作者簡(jiǎn)介〕賀佐梅，女，碩士，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)診斷（消化系統(tǒng)病病證結(jié)合唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究）。

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（81273665）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開放基金項(xiàng)目（201401）。

〔收稿日期〕2016-01-28

〔中圖分類號(hào)〕R735.3;R241

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.005