夏枯草提取物對(duì)Jurkat淋巴瘤細(xì)胞凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn)研究

馬耀臻，孫振昌，付曉瑞，蘭　宣，張明智

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

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夏枯草提取物對(duì)Jurkat淋巴瘤細(xì)胞凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn)研究

馬耀臻，孫振昌，付曉瑞，蘭宣，張明智

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

[摘要]目的探討夏枯草提取物對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。方法瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)Jurkat細(xì)胞發(fā)生的DNA降解；流式細(xì)胞儀分析Jurkat細(xì)胞經(jīng)不同濃度夏枯草提取物處理48 h后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的DNA梯形凋亡條帶，而空白對(duì)照組無DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)；流式細(xì)胞Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：夏枯草提取物(18 μg·mL(-1)、26 μg·mL(-1)、34 μg·mL(-1))處理Jurkat細(xì)胞48 h后，凋亡早期細(xì)胞在空白對(duì)照組占3.07%，在18 μg·mL(-1)組占7.58%，在26 μg·mL(-1)組占19.39%，在34 μg·mL(-1)組占34.16%。結(jié)論夏枯草提取物能夠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞]夏枯草；淋巴瘤；Jurkat細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

淋巴瘤發(fā)病率逐年上升，以化療為主的綜合治療仍是目前治療淋巴瘤的主要手段，迄今用于臨床的化療藥物毒副反應(yīng)較重，尤其是對(duì)骨髓造血功能的抑制作用常常會(huì)導(dǎo)致化療中斷，而原發(fā)或繼發(fā)耐藥往往導(dǎo)致化療失敗。

因此，尋求高效低毒的抗腫瘤藥物是目前腫瘤治療的主要研究?jī)?nèi)容之一。夏枯草作為一種傳統(tǒng)的中草藥，具有清火明目、軟堅(jiān)散結(jié)之功效。有關(guān)其抗腫瘤作用有較多的報(bào)道，如應(yīng)用夏枯草治療甲狀腺癌、淋巴肉瘤、腮腺癌、扁桃腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等由來已久?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明夏枯草具有廣泛的藥理活性。在體外腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中提示該藥能誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞、小鼠T淋巴瘤EL-4細(xì)胞及人紅白血病K562細(xì)胞的凋亡[1]。但是，夏枯草抗腫瘤有效提取物的抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥物與試劑夏枯草(產(chǎn)地：河南確山，提取物由鄭州大學(xué)藥學(xué)院提取)干燥成熟果穗經(jīng)醇煎及一系列萃取、蒸餾、干燥等過程提取而成等；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(天津TBD血液研究所)；磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Bender MedSystems公司)。

1.3主要儀器96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)，微量移液器(芬蘭Biohit公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，U-2001型紫外分光光度儀(美國(guó)Startorius公司)，PAS型流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)。

2方法

2.1夏枯草提取物對(duì)Jurkat細(xì)胞影響的片段化分析

2.1.1提取DNA收集夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)及生理鹽水處理48 h后的Jurkat細(xì)胞，UNIQ-10柱提取基因組DNA[2]。

2.1.2瓊脂糖凝膠電泳用1×TBE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，加入10 mg·mL-1溴化乙啶制膠，取DNA樣品7 μL與上樣緩沖液按5:1混勻后電泳(恒壓55 V，1 h)，成像系統(tǒng)分析并拍照。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

2.2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組：不同濃度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)處理48 h后的Jurkat細(xì)胞。對(duì)照組：加入等體積的生理鹽水。

2.2.2制備單細(xì)胞懸液取不同組別Jurkat細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡的結(jié)果判定：凡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜受損，且Annexin V(+)/PI(-)的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V(+)/PI(+)的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞；Annexin V(-)/PI(-)細(xì)胞為正常細(xì)胞；Annexin V(-)/PI(+)為壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞數(shù)+ Annexin V(+)/PI(+)細(xì)胞數(shù)/檢測(cè)細(xì)胞數(shù)×100%。

2.2.3流式細(xì)胞儀分析單染PI法使用單通道620 nm綠色熒光檢測(cè)細(xì)胞，雙染Annexin V/PI法分別以525 nm、620 nm紅色熒光和綠色熒光檢測(cè)細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀的Partec FloMaX測(cè)量軟件檢測(cè)每個(gè)樣品20 000個(gè)細(xì)胞。單染PI法采用Partec FloMaX軟件分析20 000個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比率。雙染Annexin V/PI法直接測(cè)得每個(gè)樣本20 000個(gè)細(xì)胞中正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細(xì)胞所占的比例。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0處理相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1夏枯草提取物誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞凋亡的作用不同濃度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)處理Jurkat細(xì)胞48 h后引起細(xì)胞凋亡，DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)明顯的DNA梯形凋亡條帶(DNA ladder band)，提示DNA在核小體間斷裂，呈細(xì)胞凋亡的典型特征，而培養(yǎng)時(shí)間相同的空白對(duì)照組無DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)。見圖1。

圖1　不同濃度夏枯草提取物

1：加藥34 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；2：加藥26 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；3：加藥18 μg·mL-1組，DNA加樣量7 μL；4：空白對(duì)照組，DNA加樣量7 μL

2.2夏枯草提取物處理Jurkat細(xì)胞48 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將Annexin V與PI匹配使用，利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)不同濃度的夏枯草提取物作用于Jurkat細(xì)胞在48 h后的凋亡百分率。1)活細(xì)胞在空白對(duì)照組占91.23%；在18 μg·mL-1組占88.25%；在26 μg·mL-1組占47.04%；在34 μg·mL-1組占10.52%。隨著作用濃度的增加，活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2)凋亡早期細(xì)胞在空白對(duì)照組占3.07%；在18 μg·mL-1組占7.58%；在26 μg·mL-1組占19.39%；在34 μg·mL-1組占34.16%。隨著作用濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2　夏枯草提取物處理Jurkat細(xì)胞不同濃度的細(xì)胞凋亡率變化

%

注：26 μg·mL-1組、34 μg·mL-1組與空白對(duì)照組比較，P<0.05；各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較，P均<0.05

3討論

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前研究最為熱點(diǎn)的中草藥抗腫瘤機(jī)制。越來越多的研究[1-2]表明，中草藥抗腫瘤的療效與中草藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡是一種有別于細(xì)胞壞死的，細(xì)胞主動(dòng)參與并遵循一定程序的自我消亡過程，是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控有機(jī)體發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程[3-4]。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，但嚴(yán)格說來，兩者不是指的同一現(xiàn)象，程序性死亡是功能上的概念，凋亡是形態(tài)上的概念，并不是所有的程序性死亡都表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征[5]。細(xì)胞凋亡不僅對(duì)胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、變態(tài)反應(yīng)及保持機(jī)體自穩(wěn)等過程至關(guān)重要，而且通過細(xì)胞凋亡，機(jī)體能及時(shí)清除過多的、受損的或惡變的細(xì)胞。正常的細(xì)胞凋亡被抑制，可能是各種惡性腫瘤和自身免疫性疾病的重要發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞凋亡具有特殊的形態(tài)和生化特征。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為：首先是胞體縮小，失去微絨毛，與周圍細(xì)胞失去聯(lián)系，細(xì)胞器變致密，核體積縮小，核仁消失，染色質(zhì)濃集于核膜表面，形成新月形致密小斑塊；接著染色體斷裂，核膜和細(xì)胞膜均內(nèi)陷，自行分割為多個(gè)外有膜包裹、內(nèi)含物不外溢的凋亡小體，最終被鄰近細(xì)胞所識(shí)別、吞噬。

研究細(xì)胞凋亡的方法有很多。形態(tài)學(xué)觀察是檢測(cè)細(xì)胞凋亡最可靠的方法，主要是通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行各種染色，如HE染色、甲基綠-呱諾寧染色、Giemas染色等。在普通光學(xué)顯微鏡下常用熒光染料如叮嚨橙、Heochst33258染色在熒光顯微鏡下觀察;或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區(qū)別細(xì)胞凋亡和壞死。但這些傳統(tǒng)的方法僅局限在大體形態(tài)上，遠(yuǎn)不能勝任精確的定性、定量，因此，限制了其應(yīng)用。

而其他的凋亡生化特征的檢測(cè)方法有：TUNEL檢測(cè)法、ELISA檢測(cè)法、DNA凝膠電泳法、Annexin V與PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡法。1)TUNEL檢測(cè)法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞和早期凋亡，缺點(diǎn)是因需固定細(xì)胞可出現(xiàn)DNA片段丟失；2)DNA凝膠電泳法的原理是凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180～200 bp DNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別，缺點(diǎn)是定量較困難；3)ELISA檢測(cè)法敏感性高，可檢測(cè)5～100 ·mL-1個(gè)凋亡細(xì)胞，不需要特殊儀器，操作方便，但是不能精確測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕對(duì)量；4)Annexin V與PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡法的原理是細(xì)胞在正常生存狀態(tài)下，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。PI是一種核酸染料，其不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Annexin V對(duì)細(xì)胞染色，可使早期凋亡細(xì)胞膜外表面暴露的PS于Annexin V/FITC特異性結(jié)合而出現(xiàn)綠色熒光，但細(xì)胞仍維持其細(xì)胞膜的完整性，使變性染色質(zhì)著色的熒光染料PI不能進(jìn)入細(xì)胞，然而壞死或凋亡晚期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞可同時(shí)受Annexin V和PI標(biāo)記，借助流式細(xì)胞儀可定量分析受標(biāo)記的凋亡壞死細(xì)胞數(shù)。此方法不需固定細(xì)胞，因此，操作方便，更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡定性與定量的方法。

本研究中，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，不同濃度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 g·mL-1、34 μg·mL-1)作用于Jurkat細(xì)胞48 h后引起細(xì)胞凋亡，電泳可見明顯的DNA梯形凋亡條帶，且隨藥物濃度的增加，凋亡帶逐漸變寬，而空白對(duì)照組無DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)。不同濃度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)作用Jurkat細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性。其中18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1組活細(xì)胞分別為88.25%、47.04%、10.52%；早期細(xì)胞凋亡率分別為7.58%、19.39%、34.16%，26 μg·mL-1組和34 μg·mL-1組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

上述結(jié)果提示，夏枯草提取物可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，這可能是其抗腫瘤作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]張明智,鄭曉珂,劉宏民.夏枯草提取物體外誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2008,40(4):80-83.

[2]孫振昌,付曉瑞,崔瑩瑩,等.夏枯草提取物作用Jurkat細(xì)胞的分子生物學(xué)研究[J].中藥材，2014，37(8)：1441-1444.

[3]劉新奎,王琳,張明智.JNK和Caspase-3在夏枯草引起人淋巴瘤細(xì)胞凋亡中的作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2010,90(10):690-693.

[4]張明智,孫振昌,付曉瑞,等.夏枯草提取物作用Jurkat細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J] .中藥材，2009，32(6)：917-922.

[5]付曉瑞，孫振昌，張明智.夏枯草提取物誘導(dǎo)B、T淋巴瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥材，2012，35(3)：433-438.

Effects of Selfheal Extract on Jurkat Cell Apoptosis

Ma Yaozhen, Sun Zhenchang, Fu Xiaorui, Lan Xuan, Zhang Mingzhi

(DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of selfheal extract on Jurkat cell apoptosis.MethodsDetect the DNA degradation of Jurkat cells exposured to different concentration of selfheal extract through agarose gel electrophoresis and analyze cell apoptosis rate by flow cytometry after 48 hours.ResultsAgarose gel electrophoresis of the DNA showed typical DNA ladder in the experimental groups, which wasn’t observed in the blank control group; Annexin V/PI by flow cytometry to detect cell apoptosis revealed that early apoptosis cells rate of Jurkat cells exposured to selfheal extract with the concentration of 18 μg·mL(-1), 26 μg·mL(-1), 34 μg·mL(-1) accounted for 7.58%,19.39%,34.16% respectively compared with 3.07% in the blank control group after 48 hours.ConclusionThe selfheal extract can induce the apoptosis of Jurkat cells.

[Key words]selfheal; lymphoma; Jurkat cells; cell apoptosis

(收稿日期：2015-10-12)

[中圖分類號(hào)]R733.1；R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2016)02-0106-04

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.02.004

作者簡(jiǎn)介：馬耀臻(1990-)，男，碩士，主要從事淋巴瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。通信作者：張明智(1962-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事淋巴瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：mingzhi_zhang@126.com