熱應(yīng)激及熱應(yīng)激預(yù)處理對小鼠學(xué)習(xí)記憶以及情緒的影響

萬娜，成亞純，肖娟娟

·基礎(chǔ)研究·

熱應(yīng)激及熱應(yīng)激預(yù)處理對小鼠學(xué)習(xí)記憶以及情緒的影響

萬娜1，成亞純1，肖娟娟2

目的：從行為學(xué)角度研究熱應(yīng)激（HS）及熱應(yīng)激預(yù)處理（HP）對小鼠學(xué)習(xí)記憶及情緒的影響。方法：雄性昆明小鼠32只隨機分為對照組、HP組、HS組、（HP+HS）組4組各8只。通過Morris水迷宮評價小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，開場試驗評價小鼠自主活動，采用中國地鼠情緒喚醒水平評定量表測定情緒喚醒水平。結(jié)果：Morris水迷宮結(jié)果顯示，與對照組相比，HS組尋找平臺潛伏期延長，HP組尋找平臺潛伏期縮短，（HP+HS）組尋找平臺潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（HP+HS）組與HS組相比，水平運動、垂直運動均有所增多（P＜0.05）;空間搜索試驗中，與對照組比較，HS組在目標象限停留的時間明顯延長，在目標象限對側(cè)的第三象限停留時間縮短（P＜0.05）；開場試驗中，與對照組相比，HS組水平運動、垂直運動、糞便粒數(shù)均減少（P＜0.05），中央格時間延長（P＜0.05）。結(jié)論：HP可使學(xué)習(xí)記憶能力加強，而急性HS則對學(xué)習(xí)記憶能力有損害作用，HP可對此損害產(chǎn)生一定保護作用，HS對學(xué)習(xí)記憶能力的影響隨應(yīng)激后時間推移有減弱趨勢。HP使小鼠自主活動增強，急性HS可使自主活動降低。急性HS造成情緒喚醒降低，HP不改變情緒喚醒水平；HS及HP均可降低小鼠的體重。

熱應(yīng)激；熱應(yīng)激預(yù)處理；學(xué)習(xí)記憶；開場行為；情緒喚醒

熱應(yīng)激（heat stress，HS）是指人或動物暴露在高溫環(huán)境中時，所產(chǎn)生的機體可以感知的一系列不適及生理上的疲勞狀態(tài)等非特異性全身反應(yīng)的總和[1,2]。環(huán)境溫度的升高是一種物理信號的應(yīng)激，其對機體的影響首先表現(xiàn)在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，細胞外遞質(zhì)/激素濃度和其細胞膜上相應(yīng)受體的結(jié)合容量發(fā)生變化，這些改變作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并最終引起體溫調(diào)節(jié)平衡效應(yīng)。研究證實，適當程度和強度的熱應(yīng)激即熱應(yīng)激預(yù)處理（heat stress preconditioning，HP）可增強機體對抗外界有害應(yīng)激的能力，如可提高機體耐受高溫、缺血的閾值等。本實驗觀察HP及HS后小鼠的行為學(xué)變化，研究HP及HS對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及情緒的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性昆明小鼠32只，6周齡，體質(zhì)量（20～25）g，購自上海大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：（22±1）℃，相對濕度40%～50%，自然晝夜，非直接光照，自由攝食及飲水。

1.1.2 主要實驗材料 Morris水迷宮（購于北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；自制簡易熱應(yīng)激倉；自制敞箱裝置：敞箱由不透明材料制成，為50 cm× 50 cm×50 cm立方體，白線等分為25個等邊方格；敞箱底面及周壁為黑色。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 采用隨機數(shù)字表將所有小鼠隨機分為4組，各8只：對照組、急性熱應(yīng)激（HS）組、熱應(yīng)激預(yù)處理（HP）組、熱應(yīng)激預(yù)處理后急性熱應(yīng)激（HP+HS）組。

1.2.2 HS動物模型建立 HP操作方法：動物在常溫（22±1）℃下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗當天將實驗小鼠與鼠籠一起放入帶鼓風(fēng)裝置的烤箱內(nèi)進行HS，溫度（42±0.5）℃，時間為120 min。結(jié)束后測小鼠肛溫為42℃，則HS模型建立成功。（HP+HS）組的小鼠在HP后的24 h與HS組小鼠同時進行HS。HP組在HP后不給予急性HS處理；對照組小鼠不作HS處理，于常溫下飼養(yǎng)并置于未加熱的烤箱內(nèi)相同時間[3]。

1.2.3 行為學(xué)檢測 急性HS結(jié)束后，將小鼠取出至常溫下，對4組小鼠進行開場行為測試，記錄各組小鼠在敞箱中的水平格數(shù)、垂直次數(shù)、修飾次數(shù)、中央時間及糞便顆粒數(shù)。于急性HS后當天恢復(fù)至常溫時及第2天行Morris水迷宮測試，記錄各組小鼠尋找平臺的潛伏期，評價小鼠學(xué)習(xí)能力；記錄各組小鼠在各象限停留的時間，評價小鼠的空間搜索能力。于每次水迷宮測試前，采用中國地鼠情緒喚醒水平評定量表測定情緒喚醒水平。行為評定需每次由3個人同時觀察，在單盲條件下進行記錄。

1.2.4 小鼠體質(zhì)量監(jiān)測 于HP前和HS后0、12、24、30、36 h測量各組小鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量差/g=（實驗前體質(zhì)量-實驗后體質(zhì)量）/g。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HS對小鼠開場行為的影響

與對照組相比，HS組小鼠水平運動、垂直運動、糞便粒數(shù)明顯減少，中央格時間延長（P＜0.05），但修飾次數(shù)無明顯的變化（P＞0.05）；HP組小鼠的水平運動、垂直運動、修飾次數(shù)增多，中央格停留時間減少（P＜0.05），糞便粒數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；（HP+HS）組修飾次數(shù)減少、中央格停留時間增加（P＜0.05），其他參數(shù)變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與HS組相比，HP組水平運動、垂直運動、修飾次數(shù)、糞便粒數(shù)增加（P＜0.05），中央格停留時間減少（P＜0.05）；（HP+HS）組水平運動、垂直運動、糞便粒數(shù)增多（P＜0.05），修飾次數(shù)及中央格停留時間無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 小鼠開場行為變化（）

表1 小鼠開場行為變化（）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與HS組比較，②P＜0.05

組別對照組H S組H P組（H P + H S）組只數(shù)8 8 8 8水平格數(shù)/格1 3 0 . 8 8 ± 6 . 1 0 1 0 8 . 0 0 ± 4 . 9 9①1 4 7 . 1 3 ± 4 . 4 2①②1 2 7 . 3 7 ± 2 . 1 3②垂直次數(shù)/次3 1 . 5 0 ± 1 . 7 7 2 2 . 1 3 ± 2 . 0 3①3 8 . 1 3 ± 2 . 0 3①②2 9 . 3 8 ± 2 . 4 5②組別對照組H S組H P組（H P + H S）組修飾次數(shù)/次1 2 . 5 0 ± 1 . 1 9 1 0 . 2 5 ± 1 . 1 6 1 5 . 5 0 ± 1 . 6 0①②1 0 . 6 3 ± 1 . 6 8①中央時間/ s 4 . 6 2 ± 1 . 0 6 1 3 . 6 2 ± 1 . 6 9①3 . 2 5 ± 0 . 7 1①②1 2 . 3 8 ± 1 . 6 9①糞便顆數(shù)/粒3 . 5 0 ± 0 . 5 3 1 . 3 7 ± 0 . 5 2①2 . 8 8 ± 0 . 8 3②3 . 2 5 ± 0 . 4 6②

2.2 HS對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1HS對小鼠定位航行學(xué)習(xí)能力的影響 在定位航行學(xué)習(xí)中，時間因素具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明各組小鼠的逃避潛伏期都有隨時間變化而縮短的趨勢。與對照組比較，在第1天的第一次、第二次定位航行試驗中，HS組小鼠逃避潛伏期延長，HP組和（HP+HS）組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；與HS組比較，HP組和（HP+HS）組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05）。與對照組相比，在第2天的第三次、第四次定位航行試驗中，HS組逃避臺潛伏期延長（P＜0.05）；與HS組比較，HP組和（HP+ HS）組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05），見表2。

表2 HS后各組小鼠逃避潛伏期比較（s，）

表2 HS后各組小鼠逃避潛伏期比較（s，）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與HS組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù) 第一次航行試驗 第二次航行試驗對照組H S組H P組（H P + H S）組8 8 8 8 7 5 . 3 7 ± 5 . 1 8 9 3 . 5 0 ± 2 . 2 0①6 3 . 2 5 ± 2 . 3 7①②6 0 . 2 5 ± 2 . 3 7①②6 3 . 2 5 ± 4 . 6 8 7 8 . 3 8 ± 2 . 6 7①4 9 . 5 0 ± 2 . 4 5①②4 7 . 7 5 ± 2 . 5 5①②組別對照組H S組H P組（H P + H S）組第三次航行試驗4 2 . 8 8 ± 5 . 6 4 6 4 . 3 8 ± 1 . 6 9①4 3 . 6 2 ± 2 . 3 8②4 1 . 1 3 ± 1 . 4 5②第四次航行試驗3 6 . 6 3 ± 2 . 5 6 4 5 . 3 8 ± 1 . 6 9①3 1 . 8 7 ± 2 . 3 6②3 7 . 7 5 ± 2 . 7 1②

2.2.2 HS對小鼠空間搜索能力的影響 各組小鼠均在目標象限（第1象限）停留的時間最長；其中對照組小鼠在第1象限停留時間與在第2、3、4象限停留時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而HS組小鼠在第1象限停留時間與其它3個象限停留時間差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組小鼠比較，HS組小鼠在第1象限停留的時間明顯延長（P＜0.05），而在第1象限對側(cè)的第3象限停留時間則有所縮短（P＜0.05）；其它各組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

表3 HS后各組小鼠在各象限的停留時間比較（s，）

表3 HS后各組小鼠在各象限的停留時間比較（s，）

注：與第1象限停留時間比較，①P＜0.05；與對照組比較，②P＜0.05

組別對照組HS組HP組（HP+HS）組只數(shù)8 8 8 8第1象限35.37±1.30 41.25±1.28②33.50±1.51 32.63±1.69第2象限26.50±1.19①26.87±1.81①28.91±1.23 28.01±1.35組別對照組HS組HP組（HP+HS）組第3象限29.37±1.18①28.00±0.93①②28.13±1.64 27.25±1.83第4象限26.38±1.69①24.38±1.41①26.75±1.98 27.63±1.68

2.3 實驗前后體質(zhì)量比較情況

與對照組比較，（HP+HS）組小鼠0、12、24、30 h體質(zhì)量均減輕（P＜0.05），HS組24、30、36 h體質(zhì)量減輕（P＜0.05），HP組0、12、24 h體質(zhì)量減輕（P＜0.05）；0、12、24、30、36 h（即給予急性HS后0、6、12 h）（HP+HS）組的體質(zhì)量減輕大于HS組（P＜0.05）；HP組所有時間點的體質(zhì)量變化明顯大于HS組（P＜0.05），見表4。

表4 小鼠實驗前后的體質(zhì)量差比較（g，）

表4 小鼠實驗前后的體質(zhì)量差比較（g，）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與HS組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù)0 h 1 2 h對照組H S組H P組（H P + H S）組8 8 8 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 1 . 0 1 ± 0 . 3 4①②1 . 2 5 ± 0 . 4 8①②-0 . 5 0 ± 0 . 1 7 -0 . 4 8 ± 0 . 9 6 2 . 8 9 ± 0 . 3 6①②3 . 6 5 ± 0 . 5 6①②組別對照組H S組H P組（H P + H S）組2 4 h -0 . 7 1 ± 0 . 2 0 0 . 2 6 ± 0 . 7 4①1 . 0 7 ± 0 . 4 7①②1 . 3 5 ± 0 . 4 0①②3 0 h -1 . 1 0 ± 0 . 4 4 2 . 0 9 ± 0 . 3 4①-1 . 0 7 ± 0 . 3 6②1 . 4 9 ± 0 . 6 7①②3 6 h -1 . 7 6 ± 0 . 7 1 1 . 6 9 ± 0 . 5 4①-1 . 6 1 ± 0 . 5 7②-0 . 3 5 ± 0 . 4 5②

2.4 情緒喚醒水平的評定

4次測定中各組得分均有逐漸下降的趨勢，與對照組比較，HS組和（HP+HS）組的得分均降低（P＜0.05）；與HS組比較，HP組第1、3次得分均增加（P＜0.05），見表5。

3 討論

HP是指經(jīng)過一定時長和強度的熱預(yù)處理后的組織對隨之而后遭遇的損傷耐受閾值有所提高的現(xiàn)象[4-6]。研究認為通過HP可以提高機體在細胞及器官水平對外界有害應(yīng)激的耐受能力[6-10]。國際公認的HP標準為升高動物肛溫至42℃，并維持此溫度25 min[11]。本實驗成功建立HS模型和HP模型，與HS組和對照組比較。HP對機體雖然會造成一定程度可逆轉(zhuǎn)的損傷如體質(zhì)量減輕，但對HS產(chǎn)生的學(xué)習(xí)記憶能力損傷有一定的保護作用，同時還可緩解HS造成的自主活動減少。有報道，HP的熱保護作用在分子水平表現(xiàn)為，可有效抑制HS后早期大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性及表達的升高，同時它還可使皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中NOS水平恢復(fù)致正常的過程加快[12]。

表5 小鼠情緒喚醒水平得分（分，）

表5 小鼠情緒喚醒水平得分（分，）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與HS組比較，②P＜0.05

組別對照組HS組HP組（HP+HS）組只數(shù)8 8 8 8第1次5.25±1.28 2.25±0.71①4.75±0.71②2.75±0.71①第2次3.00±0.76 1.88±0.99①2.38±0.74 1.50±1.20①組別對照組HS組HP組（HP+HS）組第3次2.50±0.93 1.38±0.74①2.13±0.83②0.88±0.83①第4次2.33±0.87 1.12±0.66①2.01±0.76 0.81±0.54①

與對照組相比，HS組、HP組、（HS+HP）組小鼠的體質(zhì)量均有明顯的下降（P＜0.05）；與HS組相比較，（HP+HS）組小鼠的體質(zhì)量在0、12、24、30、36 h均明顯高于HS組(P＜0.05)。本研究結(jié)果顯示，HS及HP均能顯著降低小鼠的體質(zhì)量，且與（HS+HP）小鼠相比，單純給予HS干預(yù)的小鼠的體質(zhì)量下降的程度更大。

Morris水迷宮結(jié)果顯示，與對照組相比，單純HP可使學(xué)習(xí)記憶能力加強，而急性HS處理則對學(xué)習(xí)記憶能力有損害作用，HP可對此損害產(chǎn)生一定保護作用，但HS對學(xué)習(xí)記憶能力的影響隨應(yīng)激后時間推移有減弱趨勢。有研究認為，在高溫下中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長因子表達增加，使神經(jīng)細胞熱損傷得到有效保護。在腦缺血后6 h，腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurophic factor，BDNF）的表達開始增高，表達高峰為第3天[13,14]。同時，本實驗結(jié)果顯示，HP后給予HS的小鼠在1 d的試驗中，潛伏期較對照組明顯縮短，表明HP后給予HS仍然對小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力有一定增強作用，且其效益高于單純給予HP組，目前其具體的機制仍有待進一步研究澄清。

開場實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HS可造成情緒喚醒水平降低，而單純HP并未造成明顯情緒喚醒影響，HP對緩解HS引起的情緒喚醒降低無明顯作用。在高溫環(huán)境時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可出現(xiàn)先興奮后抑制的現(xiàn)象。高溫下大腦皮質(zhì)調(diào)節(jié)的中樞興奮性增加，而負誘導(dǎo)使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)運動功能受到抑制，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)反應(yīng)得到加強，導(dǎo)致血液中的抗利尿激素、腎素-血管緊張素II、醛固酮的濃度增加，使機體產(chǎn)熱量以及耗氧量升高，使得活動度增強。因此各組情緒喚醒和自主活動水平的差異，可能與HS時間與方式有一定關(guān)系。

綜上所述，HP可使學(xué)習(xí)記憶能力加強，而急性HS則對學(xué)習(xí)記憶能力有損害作用，HP可對此損害產(chǎn)生一定保護作用，HS對學(xué)習(xí)記憶能力的影響隨應(yīng)激后時間推移有減弱趨勢。HP使小鼠自主活動增強，急性HS可使自主活動降低，HP可減少此影響。急性HS造成情緒喚醒降低，HP不能其影響作用；HP不改變情緒喚醒水平；HS及HP均可降低小鼠的體重，且單純給予HS干預(yù)的小鼠的體質(zhì)量下降的程度更大。

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（本文編輯：唐穎馨）

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.019

1.湖北省應(yīng)城市人民醫(yī)院湖北 應(yīng)城 432400

2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院湖北 咸寧 430073

湖北科技學(xué)院校級青年課題（No.KY11070）

2015-11-15

肖娟娟xjjuan2006@126.com