彌漫性軸索損傷患者的血清NF-L表達(dá)變化

史立信，胡福廣，顧春雷，王冰，張文超，王傳海

彌漫性軸索損傷患者的血清NF-L表達(dá)變化

史立信1，胡福廣2，顧春雷3，王冰4，張文超1，王傳海1

目的：探討彌漫性軸索損傷（DAI）患者血清中的神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽（NF-L）的濃度與DAI病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性。方法：選擇DAI患者95例（DAI組）和健康體檢者65例（正常對(duì)照組），采用ELISA檢測(cè)2組血清中NF-L的濃度。結(jié)果：損傷后7 d內(nèi)，DAI組血清中NF-L的濃度均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ROC曲線顯示血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL對(duì)于輔助診斷DAI的敏感性與特異性最高。DAI死亡患者血清NF-L濃度明顯高于存活患者。結(jié)論：血清NF-L濃度與DAI損傷嚴(yán)重程度及患者預(yù)后具有相關(guān)性。關(guān)鍵詞 神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽；彌漫性軸索損傷；特異性；準(zhǔn)確性

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）的基本病變包括神經(jīng)軸索的彌漫性損傷，胼胝體及上腦干背側(cè)局灶性損傷，即DAI三聯(lián)征[1]。DAI患者最突出的臨床特點(diǎn)是傷后原發(fā)性昏迷，表現(xiàn)為去大腦強(qiáng)直或去皮質(zhì)強(qiáng)直，意識(shí)恢復(fù)較慢[2]，約占重型顱腦損傷的28%～42%，在死亡患者中占29%～43%。病情危重，病死率和致殘率高，是導(dǎo)致顱腦損傷患者神經(jīng)功能障礙、植物狀態(tài)和死亡的主要原因[3-5]。目前DAI的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征，但CT及MRI的特異性及準(zhǔn)確性不高，所以尋求顱腦創(chuàng)傷后DAI發(fā)病過(guò)程中的生物標(biāo)志物的變化進(jìn)行早期診療[6-10]，以期改善患者預(yù)后。本文研究DAI發(fā)病過(guò)程中血清神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽（neurofilament light polypeptide，NF-L）的表達(dá)、變化，對(duì)其在DAI診斷、預(yù)后判斷中的價(jià)值進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月1日至2015年1月1日清河縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的顱腦創(chuàng)傷后DAI患者95例為DAI組，男28例，女67例；年齡12～74歲；格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow coma scale，GCS）評(píng)分3～5分58例，6～8分 37例；格拉斯哥預(yù)后分級(jí)（Glasgow outcome scale，GOS）1級(jí)（死亡）13例、2級(jí)（植物人狀態(tài)）0例、3級(jí)（重殘）45例、4級(jí)（中殘）24例、5級(jí)（輕殘）13例；DAI程度分級(jí)1級(jí)21例、2級(jí)32例、3級(jí)42例。另選取同期在本院常規(guī)體檢的健康人65例為對(duì)照組，男44例，女21例；年齡18～61歲。2組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

Kayto RT-6000酶標(biāo)儀、Kayto RT-3000洗板機(jī)、Ketong恒溫箱及TOSHIBA全自動(dòng)生化分析儀均借用于本院檢驗(yàn)科。NF-L酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)公司。

1.3 方法

對(duì)照組采集靜脈血，DAI組受傷8 d內(nèi)每隔12 h采集外周靜脈血低溫保存，檢測(cè)血清中NF-L含量。包被：用0.05 mol/L pH9的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1 h，然后洗滌（同時(shí)設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)NF-L單克隆抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 mL，37℃孵育0.5～1 h，洗滌。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 mL顯色，37℃10～30 min。于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上進(jìn)行結(jié)果判定，NF-L濃度檢測(cè)臨界點(diǎn)為29 ng/L，檢測(cè)范圍為100～10 000 ng/L。如果檢測(cè)結(jié)果超過(guò)該濃度范圍，則對(duì)待測(cè)標(biāo)本經(jīng)過(guò)濃縮或稀釋后重新檢測(cè)3次，最后取平均值作為結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)、ROC曲線，用單因素回歸模型分析NF-L在DAI診斷與預(yù)后中的價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI組NF-L濃度的變化

損傷后7 d內(nèi)，DAI組血清中NF-L的濃度均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在損傷6 h時(shí)NFL濃度值高達(dá)（5.33±1.10）ng/mL，在24 h時(shí)達(dá)（2.10± 0.42）ng/mL，36 h后便迅速下降（圖1）。

圖1 2組血清中NF-L濃度比較

2.2 血清NF-L在DAI診斷中的價(jià)值

根據(jù)ROC曲線分析和正確診斷指數(shù)（Youden指數(shù)）最大截?cái)帱c(diǎn)原則，用NF-L診斷DAI的曲線下面積為 0.912，95%置信區(qū)間為 0.901～0.943（P＜0.01），Youden最大值為 0.66，所對(duì)應(yīng)的血清 NF-L為3.85 ng/mL，此為NF-L在DAI中的最佳診斷界點(diǎn)，此時(shí)靈敏度為82.73%，特異度為84.81%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.34%，陰性預(yù)測(cè)值為82.36%，漏診率為17.27%，誤診率為15.19%（圖2）。根據(jù)該曲線可知，血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL可輔助診斷外傷后DAI的診斷，其敏感性與特異性最高。

圖2 血清NF-L對(duì)DAI的診斷效能ROC曲線

2.3 血清NF-L濃度與DAI嚴(yán)重程度的相關(guān)性

DAI組中，DAI1、2、3級(jí)患者的血清NF-L濃度分別為（1.21±0.02）、（2.79±0.13）、（4.53±0.03）ng/mL，DAI2、3級(jí)患者的NF-L值均明顯高于1級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，P=0.01）。

2.4 NF-L與DAI組死亡患者結(jié)果的相關(guān)性分析

DAI組中，7 d內(nèi)的死亡患者和存活患者在受傷后6 h血清中NF-L的濃度分別為（8.42±2.51）、（1.00± 0.21）ng/mL，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。單變量回歸分析發(fā)現(xiàn)，DAI組血清NF-L＞5.22 ng/mL是預(yù)測(cè)DAI死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立因子（表1）。

3 討論

近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)了許多與顱腦創(chuàng)傷后相關(guān)的生物標(biāo)記物[11,12]，它們?cè)贒AI的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有明顯變化，且與病情的發(fā)展及預(yù)后有一定的相關(guān)性[13]。理想的生物學(xué)標(biāo)記物需要滿(mǎn)足以下條件：對(duì)顱腦創(chuàng)傷的特異性和敏感性高；能反映損傷的嚴(yán)重程度；在體液中快速表達(dá)；能反映損傷機(jī)制；能監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展及對(duì)治療的反應(yīng)；能對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)估[14]。

DAI時(shí)神經(jīng)元發(fā)生軸索斷裂、分解等損傷，腦白質(zhì)纖維受損后的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和修復(fù)反應(yīng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的變化，它們與DAI的發(fā)生緊密相關(guān)，對(duì)早期診斷DAI及制訂治療策略有重要意義[15,16]。神經(jīng)微絲屬于中間絲蛋白家族的第Ⅳ類(lèi)成員，特異地在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，NF是神經(jīng)元中直徑10 nm的中間絲，是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要成分，負(fù)責(zé)軸漿運(yùn)輸，在維持神經(jīng)元正常形態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。NF分為3種亞型，即輕鏈蛋白（NF-L，分子量為68 kD）、中鏈蛋白（NFM，分子量為160 kD）、重鏈蛋白（NF-H，分子量為200 kD）[17]。NF的結(jié)構(gòu)變化是軸索損傷最早、最有特征性的表現(xiàn)形式，它是軸索腫脹的始動(dòng)因素[12]。NF-L在神經(jīng)元中含量最豐富，其活性的改變與神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)[18,19]。NF-L是對(duì)DAI最敏感的亞基，傷后0.5～2 h即可在腦脊液中檢測(cè)到其降解產(chǎn)物[20]，并且腦脊液中NF-L的濃度亦會(huì)明顯升高[14]。其病理生理基礎(chǔ)為：DAI后NF-L發(fā)生異常磷酸化、減緩NF-L自細(xì)胞體向軸突的運(yùn)輸，軸突斷裂后，斷端回縮可引起磷酸化的NF-L從軸突向細(xì)胞體逆流，導(dǎo)致NF-L在細(xì)胞體內(nèi)異常聚集，使損傷神經(jīng)元細(xì)胞體的NF-L含量增加、濃度升高[21]。

本文結(jié)果顯示DAI發(fā)生后很早就能檢測(cè)出NF-L，DAI組血清中NF-L濃度明顯高于對(duì)照組，并與損傷嚴(yán)重程度和死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在DAI后血清中還存在NFL濃度第2個(gè)小高峰（圖1），這可能與顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)的顱內(nèi)高壓或低氧血癥有關(guān)。

本文通過(guò)繪制ROC曲線的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL對(duì)DAI診斷的特異性和敏感性最高，這與國(guó)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[22,23]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DAI后12 h內(nèi)血清NF-L的升高與患者DAI嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，這與通過(guò)入院時(shí)GCS評(píng)分所的結(jié)果一致；并且患者DAI后3月內(nèi)的死亡率還與受傷6 h內(nèi)血清NF-L的升高及本研究期內(nèi)的平均值顯著相關(guān)。筆者推測(cè)在神經(jīng)元損傷后，NF-L進(jìn)入細(xì)胞外液，再通過(guò)受損的血腦屏障入血直至達(dá)到平衡[24]，所以血清NF-L能準(zhǔn)確反應(yīng)腦組織、神經(jīng)元及血腦屏障的損傷程度，判斷DAI的預(yù)后、預(yù)測(cè)死亡方面具有重要的參考價(jià)值。

本文的不足之處在于，樣本量偏小，在后續(xù)研究中應(yīng)擴(kuò)大DAI患者的數(shù)量；實(shí)驗(yàn)中對(duì)DAI病情的判斷主要依靠入院時(shí)GCS評(píng)分和隨訪中GOS評(píng)分，主觀性偏強(qiáng)，今后研究中應(yīng)該盡量多地采用基于MRI、CT等客觀檢查的病情判斷手段。

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（本文編輯：王晶）

Expression Changes of Serum NF-L Levels in Patients with Diffuse Axonal Injury

SHI Li-xin1, HU Fu-guang2,GU Chun-lei3,WANG Bing4,ZHANG Wen-chao1,WANG Chuan-hai1.1.Department of Neurosurgery,People’s Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;2.Department of Neurosurgery,The second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 054800,China;3.Department of Neurosurgery,The Center Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;4.Teacher Education School of Qinghe Country,Hebei 054800,China

Objective:To investigate the correlation between the concentration of neurofilament light polypeptide(NF-L)in serum of patients with diffuse axonal injury(DAI)after brain trauma and the severity and prognosis of DAI disease.Methods:Total 95 patients with DAI(DAI group)and 65 patients with healthy physical examination(Normal control group)were enrolled.ELISA was used to detect the concentration of NF-L in the serum and CSF of the two groups.Results:The serum NF-L concentration in DAI group was significantly higher than that in the normal control group within 7 days after trauma(P＜0.05).ROC curves showed that the sensitivity and specificity was the highest for the auxiliary diagnosis of DAI when the serum NF-L concentration was higher than 3.85 ng/mL.The serum NF-L concentration of DAI patients was significantly higher in the dead patients than that in the survivors.Conclusion:The serum NF-L concentration was correlated with the severity of DAI damage and the prognosis of the patients.

R741；R684

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.012

1.河北省清河縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科河北 清河 054800

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科河北石家莊 050000

3.河北省清河縣中心醫(yī)院神經(jīng)外科 河北 清河 054800

4.河北省清河縣教師進(jìn)修學(xué)校河北 清河 054800

邢臺(tái)市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.2016ZC143）

2015-12-15

史立信wbslx8099@163.com