Stanniocalcin-1對(duì)大鼠神經(jīng)元缺血性損傷的保護(hù)作用

趙蓓，姚婕，郭生龍

·論著·

Stanniocalcin-1對(duì)大鼠神經(jīng)元缺血性損傷的保護(hù)作用

趙蓓1a，姚婕2，郭生龍1b

目的：探討Stanniocalcin-1（STC-1）對(duì)神經(jīng)元缺血性損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法：分離培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，缺氧/缺糖處理構(gòu)建神經(jīng)元缺血性損傷模型。構(gòu)建過(guò)表達(dá)STC-1的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞；UCP2 siRNA轉(zhuǎn)染抑制解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blotting檢測(cè)STC-1和UCP2的mRNA及蛋白表達(dá)；乳酸脫氫酶（LDH）方法測(cè)定LDH漏出量和噻唑蘭（MTT）方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活力；檢測(cè)Caspase-3活性。結(jié)果：成功建立缺氧/缺糖神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。過(guò)表達(dá)STC-1，缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元LDH漏出量減少（P＜0.01），細(xì)胞生長(zhǎng)活力顯著升高（P＜0.05），Caspase-3活性降低（P＜0.05），且Bcl-2蛋白表達(dá)量增多（P＜0.01）；另外STC-1下游分子UCP2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）；另外，在過(guò)表達(dá)STC-1且抑制UCP2的情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)活力明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論：STC-1對(duì)缺血性損傷的神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用，可能通過(guò)調(diào)控UCP2來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷；Stanniocalcin-1；過(guò)表達(dá)；解偶聯(lián)蛋白2

近年來(lái)，心腦血管疾病發(fā)病率升高，腦卒中已成為第二大死因[1-4]。它具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)[5-7]。目前，腦卒中引起的缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷無(wú)有效治療。人類(lèi)斯鈣素（stanniocalcin-1，STC-1）于1995年發(fā)現(xiàn)[8]，不同的細(xì)胞都有表達(dá)，包括神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和巨核細(xì)胞甚至癌細(xì)胞[9-11]。有文獻(xiàn)稱(chēng)STC-1在腦神經(jīng)元中表達(dá)量較高[12]，并且對(duì)神經(jīng)元的缺氧性損傷具有保護(hù)作用[13]，但STC-1通過(guò)調(diào)控哪些分子保護(hù)神經(jīng)元，還沒(méi)有明確的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)探討過(guò)表達(dá)STC-1對(duì)缺血性損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 懷孕16 d的Wistar大鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；小牛血清及馬血清購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所；Caspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司；MTT購(gòu)自上海生工公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；解偶聯(lián)蛋白2（uncou-pling protein-2，UCP2）兔多抗、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔多抗、GAPDH兔多抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；STC-1羊多抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；Earle's液購(gòu)自森貝伽（南京）生物公司。高速常溫離心機(jī)、移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendoff公司；蛋白凝膠成像系統(tǒng)、普通PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。電泳儀購(gòu)自英國(guó)Syngene公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定 于無(wú)菌條件下取出懷孕16 d大鼠的胎鼠，將其大腦皮質(zhì)分離并置于預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中，加入0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30 min，然后用移液槍反復(fù)吹打，使細(xì)胞分離，形成密度為1.0×109/L的細(xì)胞懸液，接種于涂有多聚-D-賴氨酸的24孔板上，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含血清的DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含：10%小牛血清、10%馬血清、1×105U/L青霉素、1× 105U/L鏈霉素，pH 7.2～7.4）。24 h細(xì)胞貼壁后換液除去死細(xì)胞。第6天加入10 μmol/L阿糖胞苷培養(yǎng)24 h抑制非神經(jīng)元的生長(zhǎng)。培養(yǎng)第9天的細(xì)胞4%多聚甲醛于室溫下固定25 min，PBS清洗后0.2%Triton X-100室溫作用30 min，加入5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉30 min，兔抗鼠MAP2多抗（1∶100）4℃過(guò)夜孵育，PBS清洗后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶100），37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物護(hù)理和使用的指導(dǎo)方針，并經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 神經(jīng)元缺氧/缺糖損傷及MTT測(cè)定 取培養(yǎng)9 d的神經(jīng)元細(xì)胞，分為2組：缺氧/缺糖損傷組和正常組。將缺氧/缺糖損傷組的原培養(yǎng)液換為無(wú)糖Earle’s液，培養(yǎng)皿放入通入95%N2和5%CO2混合氣體的缺氧罐內(nèi)；正常組換成含糖的Earle’s液，各培養(yǎng)8 h，然后取出培養(yǎng)皿，棄去Earle’s液，換為無(wú)血清的DMEM，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

MTT測(cè)定：將要檢測(cè)的細(xì)胞按照每孔為1×105個(gè)細(xì)胞量接種于96孔板，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，小心棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔再加入二甲基亞砜150 μL，室溫下振蕩10 min，于OD值為490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，取其平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 載體構(gòu)建及病毒感染 據(jù)報(bào)道T29H細(xì)胞表達(dá)STC-1的量比較高，因此TRIZOL法提取8×105個(gè)T29H細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。擴(kuò)增STC-1基因全長(zhǎng)的上游引物：5’-ATGGATCCATGCTCCAAAACTCAGCAGTGCTTC-3’（粗體代表BamHI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-CGGAATTCTTATGCACTCTCATGGGATGTGCG-3’（粗體代表EcoRI酶切位點(diǎn)）。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃2 min，變形94℃30 s，退火56℃1 min，延伸72℃2 min，35個(gè)循環(huán)，延伸72℃10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物加到1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，回收且雙酶切，與用同樣雙酶切過(guò)的pBabe/嘌呤霉素逆轉(zhuǎn)錄病毒載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5a細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒并用上述酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒，獲取含病毒的上清液并貯存于-70℃。用病毒溶液感染缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元，感染24 h后用嘌呤霉素（1.5 μg/mL）篩選細(xì)胞5 d，獲得過(guò)表達(dá)STC-1的細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為了獲得過(guò)表達(dá)STC-1且抑制UCP2的細(xì)胞，利用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑將UCP2的小干擾RNA（siRNA：5’-GCUAAAGUCCGGUUACAGATT-3’）和非特異性siRNA分別轉(zhuǎn)染到過(guò)表達(dá)STC-1的細(xì)胞中，抑制UCP2的表達(dá)。分為3組：只過(guò)表達(dá)STC-1的缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元（pBabe-STC-1）組、過(guò)表達(dá)STC-1+抑制UCP2處理的缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元（pBabe-STC-1+UCP2 siRNA）組、過(guò)表達(dá)STC-1+轉(zhuǎn)染非特異性siRNA（STC-1+非特異性siRNA）組。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 收集要進(jìn)行檢測(cè)的細(xì)胞，用TRIZOL裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRTPCR的基因擴(kuò)增檢測(cè)，見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃10 min；58℃1 min，72℃1 min，共40個(gè)循環(huán)；后延伸72℃10 min。反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq II 10 μL和滅菌蒸餾水8 μL。

表1 qRT-PCR引物

1.2.6 蛋白免疫印記（Western Blot）裂解細(xì)胞，提取其中的蛋白質(zhì)，測(cè)定濃度，加上樣Buffer，置于沸水中5 min，取20 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜包括UCP2兔多抗、Bcl-2兔多抗、GAPDH兔多抗、STC-1羊多抗，稀釋度均為1∶500，PBS洗3次去除多余的抗體，室溫孵育二抗2 h包括羊抗兔二抗和小鼠抗羊二抗，二抗稀釋度為1∶1 000，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.7 過(guò)表達(dá)STC-1的免疫熒光檢測(cè) 過(guò)表達(dá)后的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫作用25 min，PBS清洗，用0.2% Triton X-100的PBS溶液室溫作用30 min，加入5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉25 min，STC-1羊多抗（1∶100）4℃過(guò)夜孵育，PBS清洗后加FITC標(biāo)記的鼠抗羊二抗（1∶100），37℃孵育1 h，DAPI作用15 min，熒光顯微鏡下觀察。培養(yǎng)第9天的細(xì)胞做相同處理，作為對(duì)照組。1.2.8 LDH和Caspase-3活性檢測(cè) 收集培養(yǎng)上清液，依據(jù)文獻(xiàn)[14]，按照試劑盒的說(shuō)明測(cè)定培養(yǎng)液中LDH和Caspase-3的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，t檢驗(yàn)，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元的鑒定和神經(jīng)元缺血性損傷上調(diào)STC-1的表達(dá)

MAP2的免疫熒光鑒定顯示神經(jīng)元細(xì)胞體及樹(shù)突均有著色，在隨機(jī)視野的150個(gè)細(xì)胞中，純度達(dá)90%以上（圖1A）。MTT法測(cè)定細(xì)胞活力顯示正常組和缺氧/缺糖損傷組細(xì)胞活力分別為（0.560±0.020）、(0.230± 0.003)，后者低于前者（P＜0.05），表明缺氧/缺糖性處理成功。正常組和缺氧/缺糖損傷組的STC-1 mRNA表達(dá)量分別為（1.01±0.02）、（1.89±0.05），蛋白表達(dá)量分別為（1.02±0.05）、（2.02±0.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這提示缺氧/缺糖損傷可引起神經(jīng)元STC-1表達(dá)量上調(diào)（圖1B）。

圖1 皮質(zhì)神經(jīng)元鑒定和神經(jīng)元缺血性損傷上調(diào)STC-1的表達(dá)

2.2 STC-1在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建STC-1的過(guò)表達(dá)載體，包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞中STC-1的mRNA和蛋白含量是否過(guò)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組：①實(shí)驗(yàn)組（pBabe-STC-1）：過(guò)表達(dá)STC-1的缺血性損傷的神經(jīng)元；②對(duì)照組：正常神經(jīng)元；③陰性組（pBabe）：用含有空載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元。對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的STC-1的mRNA表達(dá)量分別為（0.90± 0.05）、（1.90±0.80）、（7.60±1.50），STC-1蛋白表達(dá)量分別為（1.06±0.04）、（2.03±0.50）、（8.30±0.31），實(shí)驗(yàn)組的STC-1表達(dá)量較陰性組明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。另外，STC-1免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STC-1過(guò)表達(dá)后其在細(xì)胞內(nèi)的分布明顯增多，見(jiàn)圖2B-C，說(shuō)明STC-1的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)成功。

圖2 病毒轉(zhuǎn)染后各組STC-1的表達(dá)情況

2.3 STC-1過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用

對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力分別為（0.48±0.03）、（0.27±0.01）、（0.40±0.01），實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力明顯高于陰性組（P＜0.05）。另外對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的LDH漏出量分別是（6.25±0.60）、（18.62± 0.80）、（8.53±0.20），實(shí)驗(yàn)組的LDH漏出量明顯少于陰性組（P＜0.01）。

2.4 STC-1過(guò)表達(dá)使Caspase-3活性降低及Bcl-2蛋白水平升高

對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3活性分別為（0.08±0.01）、（0.29±0.03）、（0.11±0.02），實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3活性較陰性組降低（P＜0.05）。對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是（1.10±0.02）、（1.96±0.06）、（5.86±0.04），實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2蛋白表達(dá)量較陰性組顯著升高（P＜0.01）（圖3A）。這表明，過(guò)表達(dá)STC-1可對(duì)神經(jīng)元的缺氧/缺糖損傷起到保護(hù)作用。

2.5 STC-1過(guò)表達(dá)使UCP2表達(dá)量升高而減少神經(jīng)元的缺氧/缺糖損傷

為了探討STC-1對(duì)缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)其下游蛋白分子UCP2的表達(dá)變化。對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的UCP2 mRNA表達(dá)量分別為（1.30±0.06）、（1.96±0.30）、（5.90± 0.20），實(shí)驗(yàn)組高于陰性組（P＜0.01）。對(duì)照組、陰性組和實(shí)驗(yàn)組的UCP2蛋白水平表達(dá)量分別為（1.07±0.06）、（2.10±0.20）、（6.20±0.50），對(duì)照組的UCP2蛋白水平表達(dá)量較陰性組升高（P＜0.01，圖3B），與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致。同時(shí)，在STC-1過(guò)表達(dá)的情況下，本實(shí)驗(yàn)利用siRNA干擾UCP2的表達(dá)，通過(guò)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力。qRT-PCR結(jié)果顯示，pBabe組和（pBabe-STC-1+ UCP2 siRNA）組STC-1 mRNA水平表達(dá)量分別為（1.85±0.05）、（6.05±1.20），后者顯著高于前者（P＜0.01）；（STC-1+非特異性siRNA）組和（pBabe-STC-1+ UCP2 siRNA）組UCP21mRNA水平表達(dá)量分別為（5.95±0.50）、（2.36±0.89），（pBabe-STC-1+UCP2 siRNA）組低于（STC-1+非特異性siRNA）組，有顯著性差異（P＜0.01）。說(shuō)明STC-1過(guò)表達(dá)成功且UCP2干擾實(shí)驗(yàn)成功。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，（STC-1+非特異性siRNA）組細(xì)胞活力（0.47±0.03）顯著高于（pBabe-STC-1+ UCP2 siRNA）組（0.23±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），所以下調(diào)UCP2可抑制過(guò)表達(dá)STC-1后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。因此推測(cè)，STC-1可能通過(guò)對(duì)UCP2的調(diào)控來(lái)起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

圖3 各組BCl-2（A）、UCP2（B）蛋白表達(dá)

3 討論

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)最主要的部分，如何保護(hù)神經(jīng)元免受損傷是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究一直試圖解決的問(wèn)題[15-17]。STC-1對(duì)多種細(xì)胞都有保護(hù)作用，尤其在缺血性損傷中。有研究表明，心肌細(xì)胞低氧可誘發(fā)STC-1表達(dá)上調(diào)，并且起到保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷的作用[18,19]。也有報(bào)道表明，在肺臟和腎臟中，缺血也會(huì)通過(guò)上調(diào)STC-1的表達(dá)來(lái)保護(hù)細(xì)胞[20,21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠胎鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞缺氧/缺糖處理建立神經(jīng)元缺血性損傷模型，檢測(cè)到STC-1表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，過(guò)表達(dá)STC-1，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力和LDH漏出量發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)活力增強(qiáng)并且LDH漏出量減少，表明STC-1對(duì)神經(jīng)元的缺血性損傷有保護(hù)作用。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡途徑中起重要作用，它的啟動(dòng)會(huì)造成細(xì)胞凋亡[22-25]。當(dāng)細(xì)胞表面死亡受體發(fā)生活化后，Caspase-3相繼促使下游反應(yīng)發(fā)生，使很多細(xì)胞重要的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞骨架蛋白等，發(fā)生裂解，破壞這些蛋白質(zhì)正常的生理功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，Caspase-3被稱(chēng)為死亡蛋白酶，是哺乳動(dòng)物凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[26-29]。本實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)STC-1檢測(cè)到缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元中Caspase-3的活性降低，使細(xì)胞免受凋亡。另外Bcl-2也是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一類(lèi)調(diào)節(jié)因子，它的作用與Caspase-3相反，起抑制細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)STC-1上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，與Caspase-3的調(diào)控相反，說(shuō)明缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)元凋亡過(guò)程受到抑制。

UCP2是解偶聯(lián)蛋白家族之一，位于線粒體內(nèi)膜，使線粒體氧化與磷酸化脫偶聯(lián)，導(dǎo)致能量以熱的形式散發(fā)，因其與氧自由基生成以及鈣代謝等方面有極大的關(guān)系而備受關(guān)注[30-33]。而UCP2有減少自由基生成的功能[34-37]。有文獻(xiàn)表明，STC-1在很多系統(tǒng)中通過(guò)誘導(dǎo)UCPs的表達(dá)抑制超氧化物生成[38]。神經(jīng)元缺血會(huì)產(chǎn)出大量的氧自由基[6]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞中的STC-1，可使UCP2的表達(dá)量上升，從而保護(hù)缺氧/缺糖性損傷的神經(jīng)元。

目前，關(guān)于腦卒中引起的缺血性神經(jīng)元損傷的研究還不是很成熟。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞，過(guò)表達(dá)STC-1可以增強(qiáng)缺氧/缺糖神經(jīng)元的生長(zhǎng)活力并且降低細(xì)胞凋亡，表明STC-1對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用；可能通過(guò)UCP2抑制氧自由基的生成和調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血性損傷。綜上，STC-1可作為治療缺血性神經(jīng)疾病的潛在靶標(biāo)分子，其保護(hù)作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：王晶）

Protective Effect of Stanniocalcin-1 on Neuron of Rats after Ischemic Injury

ZHAO Bei1a,YAO Jie2,GUO Sheng-long1b.1.a.Department of Medical Insurance,b.Department of Neurology,Shaanxi Provincial People’s Hospital,Xi’an 710068,China;2.Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710004,China

Objective:To investigate the protective effect of Stanniocalcin-1(STC-1)on neurons after ischemic injury.Methods:The neurons were isolated from rat cortex and cultured.The cultured neurons were then subjected to anoxic and glucose-deprived injury.The retroviral of STC-1 overexpression was constructed and transfected into the neurons,which were also transfected with uncoupling protein 2(UCP2)siRNA to inhibit the UCP2 expression.The relative mRNA and protein expression levels of STC-1 and UCP2 were detected by qRTPCR and Western Blotting.The amount of LDH leakage was determined by LDH method,and cell growth and viability was determined by MTT method.The activity of Caspase-3 was detected.Results:The model of nerve cells with anoxic and OGD was constructed successfully.The up-regulation of STC-1 was verified,the amount of LDH leakage(P＜0.01)and Caspase-3 activity were significantly reduced(P＜0.05)whereas cell growth activity (P＜0.05)and the protein expression of Bcl-2 were significantly increased with STC-1 overexpression(P＜0.01). Moreover,the expression of UCP2,a downstream gene of STC-1,was also increased by STC-1 overexpression (P＜0.01).The cell growth activity was obviously reduced with STC-1 overexpression and UCP2 inhibition(P＜0.05).Conclusion:STC-1 may protect neurons against ischemic injury through regulating UCP2.

R741；R743.3

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.001

1.陜西省人民醫(yī)院a.醫(yī)保辦 b.神經(jīng)內(nèi)科西安 710068

2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科西安 710004

2015-08-31

郭生龍huiqingguohn@163. com