一測多評法同時測定胃力康顆粒中7種成分的含量*

柴士偉，屠亞茹，王興蕊，劉二偉，常艷旭，何　俊，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193；3.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津　300193）

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一測多評法同時測定胃力康顆粒中7種成分的含量*

柴士偉1，2，屠亞茹1，王興蕊1，劉二偉1，常艷旭1，何俊1，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193；3.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津300193）

摘要：[目的]建立可用于胃力康顆粒中7種成分含量測定的一測多評法。[方法]采用超高效液相色譜（UPLC），以芍藥苷為內(nèi)參物，確定蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的相對校正因子，通過相對校正因子計算各成分的含量；同時比較10批胃力康顆粒一測多評法的計算值與外標(biāo)法測定結(jié)果的差異。[結(jié)果]建立了胃力康顆粒中7種成分一測多評的含量測定方法，10批胃力康顆粒中7種成分采用一測多評法測定與外標(biāo)法測定結(jié)果無明顯差異。[結(jié)論]本實驗建立的一測多評法可用于胃力康顆粒中7種成分的含量測定，方法快速、準(zhǔn)確，可用于胃力康顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：胃力康顆粒；一測多評法；超高效液相色譜法；質(zhì)量控制

胃力康顆粒由柴胡、赤芍、枳殼、木香、丹參、延胡索、大黃、甘草等12味藥材組成[1-2]，具有行氣活血，泄熱和胃的功效，適用于胃脘疼痛、脹悶、泛酸、灼熱、噯氣、暴躁易怒、口干口苦等癥[3-6]。作為臨床常用中藥[7-10]，胃力康顆?；瘜W(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅以芍藥苷[11]作為其質(zhì)量控制指標(biāo)難以全面、客觀的反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量。本研究采用超高效液相色譜法[12-14]，以芍藥苷為內(nèi)參物，建立胃力康顆粒中7種成分（芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸）同時測定的“一測多評法”，可快速、全面、準(zhǔn)確的控制其產(chǎn)品質(zhì)量。

1　儀器與材料

1.1儀器Waters Aquity超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AX205型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli -Q超純水制備儀（Millipore公司）；Tomos 2-16 A型高速離心機（上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司）；SB-1000YDTD超聲清洗槽（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2材料甲醇為色譜純，購自Fisher公司；超純水為Milli-Q制備；芍藥苷（批號110736-200731）、蘆丁（批號11022LD01）、柚皮苷（批號110722-200610）購自中國藥品生物制品檢定所；迷迭香酸（批號20140722）、丹酚酸B（批號：20121033）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號W14-7-0）、甘草酸（批號20121098）購自天津一方科技有限公司。

胃力康顆粒購自四川綠葉寶光藥業(yè)股份有限公司，共10個批次。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Waters Aquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為0～2 min，3% A；2～11 min，3%～36% A；11～13.5 min，36%～41% A；13.5～17 min，41%～54% A，17～18 min，54%～62% A；18～23 min，62%～80% A；23～24 min，80%～3% A；流速0.4 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進樣量3 μL。

2.2對照品溶液的配制精密稱取芍藥苷、丹酚酸B對照品各5 mg，用甲醇分別配制成終濃度為5 g/L對照品溶液；精密稱取蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品各2.5 mg，用甲醇分別配制成終濃度為2.5 g/L對照品溶液。精密稱取甘草酸對照品2.5 mg，用50%的甲醇溶液配制成終濃度為2.5 g/L對照品溶液，所有對照品溶液儲存于4℃冰箱備用。

精密量取上述各對照品溶液適量，用甲醇配制成芍藥苷、丹酚酸B為500 mg/L和蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸為

250 mg/L的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱定胃力康顆粒樣品0.20 g置10 mL容量瓶中，加入純水定容至刻度，超聲15 min，冷卻，用純水補足溶液至刻度，搖勻，取1 mL該溶液，14 000 r/min離心10 min，取上清用于分析。

2.4方法學(xué)驗證

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍精密量取上述混合照品溶液，用甲醇稀釋2、5、10、25、50、125、250倍得7個濃度的混合對照品溶液，取各個濃度上述溶液，進樣3 μL分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。在該色譜條件下，芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的最低檢測限分別為0.67、0.33、0.33、0.33、0.67、0.33、0.33 mg/L，最低定量限分別為1、0.5、0.5、0.5、1、0.5、0.5mg/L。胃力康顆粒樣品及混合對照品UPLC色譜圖見圖1。

表1　胃力康顆粒中7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Equation of linear regression of seven analytes

圖1　胃力康顆粒樣品(A)和混合對照品(B) UPLC色譜圖Fig.1 The UPLC chromatogram of Weilikang granules (A) and standard solution (B)

2.4.2精密度實驗取胃力康顆粒（批號1304021），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6針，以各色譜峰峰面積值計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的峰面積RSD值分別為0.22%、0.25%、1.34%、1.34%、0.32%、0.33%和0.20%，表明方法精密度良好。

2.4.3重復(fù)性實驗取同一批號胃力康顆粒（批號1304021），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液并進行測定。計算得芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的RSD分別為0.60%，0.95%，2.02%，1.85%，0.58%，1.65%，和0.77%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性實驗取同一批胃力康顆粒樣品（批號1304021）制備的供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、24 h進行測定，芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的峰面積RSD值分別為0.99%，1.38%，1.09%，0.80%，0.38%，1.04%，0.66%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加樣回收率實驗取已知含量的胃力康顆粒樣品（批號1304021）0.1 g共6份，分別精密加入一定量的各對照品溶液，氮氣吹干。按“2.3”項下方法制備溶液，進行測定。計算芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹參酚B、大黃素-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷、甘草酸的加樣回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

表2　加樣回收實驗結(jié)果Tab.2 The recovery rate of seven effective components in Weilikang granules

2.4.6相對校正因子的計算相對校正因子（RCF）計算公式為fsi=（As/Cs）/（Ai/Ci），其中As、Cs分別為內(nèi)參物對照品s的峰面積和濃度，Ai、Ci分別為待測成分對照品i的峰面積和濃度[15-18]。

依次進樣分析各濃度的混合對照品溶液3 μL，測得各成分色譜峰峰面積。以芍藥苷為內(nèi)參物，計算蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的相對校正因子，結(jié)果分別為0.072、0.336、0.124、0.108、0.872、0.175，RSD值分別為0.35%、1.28%、1.16%、0.17%、0.25%、0.14%。

2.5相對校正因子和相對保留時間的考察采用Waters Aquity UPLC和Agilent 1290 Infinity兩個品牌的超高效液相色譜儀及CORTECS UPLC C18和ACQUITY UPLC BEH C18兩種色譜柱測定RCF和相對保留時間（RRT）。取“2.2”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋得7個濃度的混合對照品溶液，進樣3 μL，測定芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的峰面積。以芍藥苷為內(nèi)參物計算蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸RCF值和RRT值，結(jié)果見表3和表4。結(jié)果表明使用不同超高效液相色譜儀和不同色譜柱，各成分相對于芍藥苷的RCF值和RRT值的RSD均小于5%，說明該方法重現(xiàn)性較好。

2.6外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果的比較取10批胃力康顆粒，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液3 μL，進樣測定。采用外標(biāo)法和一測多評法計算樣品中蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明一測多評法與外標(biāo)法測得的各批次胃力康顆粒樣品中7種成分含量的結(jié)果相對偏差＜2%，兩種測定方法所得結(jié)果無明顯差異，一測多評法可用于胃力康顆粒的質(zhì)量控制。

表3　胃力康顆粒中6種主要成分的RCFTab.3 RCFs of six components in Weilikang granules

表4　胃力康顆粒中6種主要成分的RRTTab.4 RRT of six components in Weilikang granules

表5　一測多評法與外標(biāo)法測定胃力康顆粒中主要成分含量的結(jié)果比較Tab.5 Contents of components by external standard method and quantitative analysis of multi-components by single marker mg/g

3　討論

實驗結(jié)果表明，采用甲醇-水體系時，胃力康顆粒中各個成分分離度較差，加入甲酸后各色譜峰分離度明顯改善，且甲醇-0.1%甲酸水體系分離效果最好。并考察了乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，發(fā)現(xiàn)流動相中的有機相選用甲醇的分離效果比乙腈好。最終采用甲醇-0.1%甲酸水作為實驗的流動相。在方法建立過程中，分別考察了采用HPLC、UPLC建立檢測胃力康顆粒中7種主要成分的分析方法。結(jié)果表明，HPLC所需檢測時間較長（120 min），而UPLC僅需24 min即可完成檢測，極大的提高了檢測效率。本研究以芍藥苷為內(nèi)參物，建立了能同時測定胃立康顆粒中芍藥苷、蘆丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸7種有效成分的一測多評法，與現(xiàn)有檢測方法比較[19-20]，能夠更加快速、全面、準(zhǔn)確的控制胃力康顆粒的藥品質(zhì)量。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Simultaneous determination of seven constituents in Wenlikang granules by quantitative analysis of multi-components by single marker

CHAI Shi-wei1，2，TU Ya-ru1，WANG Xing-rui1，LIU Er-wei1，CHANG Yan-xu1，HE Jun1，3
（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2. The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 3. Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base, Tianjin 300193, China）

Abstract:[Objective] To establish a method for simultaneous determination of seven bioactive components in Weilikang Granules by quantitative analysis of multi-components by single marker（QAMS）. [Methods] Peoniflorin was select as an index，relative correction factors of Rutin，Naringin，Rosmarinic acid，Salvianolic acid B，Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside and Glycyrrhizic acid were established by UPLC and calculated to achieve QAMS. The accuracy of the new method was evaluated by comparing the results between QAMS and the external standard method. [Results] The analysis method was established and there is no significant difference between the calculated contents and the contents which were determined by external reference method in 10 batches of samples. [Conclusion] The QAMS method is reliable，accurate to control the quality of seven bioactive components of Weilikang granules.

Key words:Weilikang granules；quantitative analysi of multi-components by single marker；UPLC；quality control

收稿日期：（2015-11-30）

通訊作者：何俊，E-mail：hejun673@163.com。

作者簡介：柴士偉（1979-），男，博士研究生，主管藥師，主要從事中藥分析研究工作。

*基金項目：國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2013ZX0 9402201）。

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.04.14

中圖分類號：R927.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-1519（2016）04-0241-04