葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94在膀胱腫瘤中的表達(dá)及其對膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

盧童 徐康

膀胱腫瘤是泌尿外科中最常見的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率在腫瘤疾病譜中居前10位[2]。膀胱尿路上皮癌是其中最常見的病理類型[3]，其有易復(fù)發(fā)、侵襲性較強(qiáng)的特點，嚴(yán)重危害人類健康。目前，在腫瘤治療的領(lǐng)域里，基因治療已成為重要的研究方向，尋找合適的靶基因進(jìn)行調(diào)控則是基因治療的重要策略之一[4]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)是一類重要的分子伴侶蛋白，在避免細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡，維持細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著重要作用[5]。以往研究表明，GRP94在多種實體腫瘤中呈高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[6-10]，因此具備成為腫瘤治療靶基因的潛力。本研究中，我們檢測了GRP94在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)情況，并特異性下調(diào)GRP94在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株SW780內(nèi)的表達(dá)，觀察其對SW780細(xì)胞凋亡及遷移能力的影響，初步探討了其作用機(jī)制。

材料與方法

一、免疫組化檢測

選取2017年6月至2020年6月在我院泌尿外科因膀胱尿路上皮癌行膀胱根治性切除術(shù)患者的35例膀胱尿路上皮癌組織作為實驗組，同時將此35例患者的癌旁組織作為陰性對照組，均進(jìn)行免疫組化染色。基本步驟如下：所有組織經(jīng)固定、石蠟包埋后制作成5 μm切片，經(jīng)脫蠟入水、過氧化氫阻斷并行抗原修復(fù)后，使用anti-GRP94抗體孵育，隨后經(jīng)洗脫、二抗孵育并顯色，并在顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野，拍照后應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)采集GRP94在相應(yīng)組織內(nèi)表達(dá)的平均光密度值。

二、小干擾RNA(small interfering RNA targeting GRP94, siGRP94)合成

本研究中設(shè)計并合成了2組小RNA，其中可靶向結(jié)合GRP94 mRNA的siGRP94序列為：正義鏈5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACC-3′，反義鏈5′-GGUAAUCAGAUGCUUCUUC-3′，序列長度19 bp。同時設(shè)計1組長度同為19 bp，不結(jié)合任何人類基因的陰性對照小RNA，具體序列為：正義鏈 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人類正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液，人類膀胱尿路上皮癌BIU87、SW780細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。本研究中將SW780細(xì)胞分為3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中空白組不使用任何小RNA，陰性對照組使用陰性對照小RNA，實驗組使用靶向結(jié)合GRP94序列的siGRP94。轉(zhuǎn)染使用Polyplus公司生產(chǎn)的INTERFERin小RNA專用轉(zhuǎn)染試劑，按照操作指南進(jìn)行細(xì)胞反向轉(zhuǎn)染，所有小RNA的轉(zhuǎn)染終濃度均為25 nmol/L，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

四、Western blot檢測

將SV-HUC-1、BIU87和SW780細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后收獲，經(jīng)裂解、測定蛋白濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟處理后，再加入一抗孵育過夜，隨后經(jīng)洗脫、二抗孵育、顯影，最后對蛋白條帶拍照。對于接受轉(zhuǎn)染實驗的SW780細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，將3組細(xì)胞同時收獲后重復(fù)上述步驟進(jìn)行Western blot檢測。本研究中采用了以下一抗檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)：anti-GRP94抗體、anti-vimentin抗體、anti-caspase-9抗體、anti-Bcl-2抗體和anti-Bax抗體，內(nèi)參蛋白采用β-actin。

五、流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡率

轉(zhuǎn)染后48 h，將3組細(xì)胞收獲并重懸于緩沖液中，隨后將Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide, PI)加入細(xì)胞懸液內(nèi)雙重染色標(biāo)記，并置于流式細(xì)胞儀測定凋亡率。

六、細(xì)胞遷移實驗

轉(zhuǎn)染后48 h，將3組細(xì)胞消化、重懸，置于顯微鏡下計數(shù)，各組取相同數(shù)量細(xì)胞分別置入Transwell小室，在Transwell上室內(nèi)加入不含血清的培養(yǎng)液，下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，將遷移至小室多孔膜下表面的細(xì)胞經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色后拍照，隨后使用等量冰醋酸將著色于各組遷移細(xì)胞的結(jié)晶紫洗脫，并測定各組洗脫液的光密度值，使用下列公式計算實驗組和陰性對照組的細(xì)胞遷移抑制率：遷移抑制率=(1-各組光密度值/空白組光密度值)×100%。

七、統(tǒng)計學(xué)方法

本研究使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間計量資料應(yīng)用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GRP94在膀胱尿路上皮癌內(nèi)呈高表達(dá)

如圖1所示，免疫組化染色后，鏡下可見GRP94在癌旁組織的膀胱上皮及膀胱尿路上皮癌組織內(nèi)均呈棕黃色顆粒狀著色，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并有少量表達(dá)于細(xì)胞膜，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)檢測，35例尿路上皮癌組織中GRP94表達(dá)的平均光密度值為0.570 8±0.050 9，35例癌旁組織中GRP94表達(dá)的平均光密度值為0.269 7±0.024 6，膀胱尿路上皮癌組織內(nèi)的GRP94表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁組織(P<0.01)。

A：兩組GRP94的免疫組化染色圖(SABC法，×100)；B：兩組GRP94表達(dá)的平均光密度值(*與陰性對照組比較，P<0.01)圖1 免疫組化檢測GRP94在膀胱尿路上皮癌(實驗組)和癌旁組織(陰性對照組)中的表達(dá)

二、GRP94在SW780細(xì)胞中呈高表達(dá)

如圖2所示，GRP94在膀胱尿路上皮癌SW780和BIU87細(xì)胞株中呈高表達(dá)，表達(dá)量明顯高于正常膀胱上皮細(xì)胞株SV-HUC-1(P<0.01)，此外，SW780細(xì)胞中GRP94的表達(dá)量明顯高于BIU87細(xì)胞(P<0.01)。因此在后續(xù)siGRP94轉(zhuǎn)染實驗中采用GRP94表達(dá)量相對最高的SW780細(xì)胞。

A：不同細(xì)胞株內(nèi)GRP94的蛋白免疫印跡；B：不同細(xì)胞株內(nèi)GRP94的相對表達(dá)量(*與SV-HUC-1比較，P<0.01；#與BIU87比較，P<0.01)圖2 Western blot檢測SV-HUC-1、BIU87和SW780細(xì)胞內(nèi)GRP94的表達(dá)

三、siGRP94可有效下調(diào)SW780細(xì)胞內(nèi)GRP94的表達(dá)

將siGRP94和陰性對照RNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入SW780細(xì)胞后，采用Western blot檢測3組細(xì)胞內(nèi)GRP94的蛋白表達(dá)情況，可見轉(zhuǎn)染siGRP94的實驗組GRP94表達(dá)量較空白組和陰性對照組明顯下調(diào)(圖3，P<0.01)。

A：3組細(xì)胞內(nèi)GRP94的蛋白免疫印跡；B：3組細(xì)胞內(nèi)GRP94的相對表達(dá)量(*與空白組和陰性對照組比較，P<0.01)圖3 Western blot檢測3組SW780細(xì)胞內(nèi)GRP94的表達(dá)

四、下調(diào)GRP94表達(dá)可誘導(dǎo)SW780細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后48 h，采用Annexin V +PI雙重染色法標(biāo)記3組細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率(圖4)，其中轉(zhuǎn)染了siGRP94的實驗組SW780細(xì)胞凋亡率為(16.58±0.64)%，空白組和陰性對照組凋亡率分別為(5.25±0.26)%和(5.78±0.58)%，實驗組凋亡率明顯高于空白組和陰性對照組(P<0.01)。

A：3組細(xì)胞的凋亡散點圖(各組右上和右下象限所示為凋亡細(xì)胞)；B：3組細(xì)胞的凋亡率(*與空白組和陰性對照組比較，P<0.01)圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組SW780細(xì)胞的凋亡率

五、下調(diào)GRP94表達(dá)可抑制SW780細(xì)胞遷移能力

轉(zhuǎn)染后48 h，采用Transwell法檢測3組細(xì)胞的遷移能力，可見轉(zhuǎn)染了siGRP94的實驗組中，遷移至Transwell小室多孔膜下表面的SW780細(xì)胞數(shù)明顯少于空白組和陰性對照組(圖5)，將著色于各組遷移細(xì)胞的結(jié)晶紫洗脫后，測量洗脫液光密度值并與空白組洗脫液光密度值比，同時并計算細(xì)胞遷移抑制率，其中實驗組遷移抑制率為(52.15±3.36)%，陰性對照組為(4.47±1.23)%，實驗組SW780細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.01)。

A：3組遷移細(xì)胞的結(jié)晶紫染色圖(×400)；B：3組細(xì)胞的遷移抑制率(*與陰性對照組比較，P<0.01)圖5 Transwell小室檢測3組SW780細(xì)胞遷移能力

六、下調(diào)GRP94表達(dá)影響SW780細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控和遷移能力相關(guān)蛋白表達(dá)

采用Western blot法檢測3組細(xì)胞內(nèi)vimentin、caspase-9、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，如圖6所示，實驗組遷移能力相關(guān)蛋白vimentin表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；凋亡調(diào)控蛋白中，caspase-9前體表達(dá)下調(diào)，同時caspase-9剪切體表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，同時Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。

討 論

作為膀胱腫瘤最常見的病理類型，尿路上皮癌由于其較強(qiáng)的增殖、復(fù)發(fā)和侵襲能力成為治療腫瘤的難點，尋找合適的靶基因進(jìn)行調(diào)控則是治療此類腫瘤的一個重要策略。GRP94又名熱休克蛋白GP96，由HSP90b1基因編碼，為熱休克蛋白90家族的重要成員[5]，是分子結(jié)構(gòu)上高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留糖蛋白，具有4個主要結(jié)構(gòu)域，可與新生多肽鏈形成復(fù)合物并協(xié)助其裝配和折疊[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一類重要的核周細(xì)胞器，其分泌合成30%以上的細(xì)胞內(nèi)功能蛋白，同時也在細(xì)胞內(nèi)鈣離子的存儲以及碳水化合物等物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。諸如GRP94一類的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白可以協(xié)助新合成的多肽鏈折疊成正確的構(gòu)象并發(fā)揮其生理功能。正常情況下，由于細(xì)胞周期的嚴(yán)密調(diào)控，GRP94的表達(dá)始終控制在一定的范圍內(nèi)，而腫瘤組織由于其快速生長的特點，細(xì)胞多處于低糖、缺氧、高酸性的環(huán)境中，此時許多新生成的多肽鏈會發(fā)生錯誤折疊或未折疊的現(xiàn)象，并大量聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)并誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)。此時，為應(yīng)對UPR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞會經(jīng)過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路等調(diào)控方式上調(diào)GRP94的表達(dá)，協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生蛋白進(jìn)行折疊，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而避免細(xì)胞凋亡[12-13]。因此，GRP94在宮頸癌、食管癌、肝癌及乳腺癌等多種實體腫瘤組織中呈高表達(dá)，并表現(xiàn)出明顯促進(jìn)腫瘤增殖和進(jìn)展的作用[14-18]，但GRP94在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)及其對膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目前罕有報道。本研究中，我們采用免疫組化方法分別檢測了膀胱尿路上皮癌和其癌旁組織中GRP94的表達(dá)，結(jié)果顯示，腫瘤組織中GRP94表達(dá)的平均光密度值明顯高于癌旁組織，說明GRP94在膀胱腫瘤中表達(dá)上調(diào)。同時，我們檢測了膀胱正常上皮細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株和膀胱尿路上皮癌BIU87、SW780細(xì)胞株中GRP94的表達(dá)水平，同樣顯示膀胱腫瘤細(xì)胞株中GRP94表達(dá)較正常膀胱上皮細(xì)胞明顯上調(diào)。結(jié)合GRP94的功能來看，這種表達(dá)上調(diào)可能與維持膀胱腫瘤細(xì)胞的生存等生物行為有關(guān)。

A：3組細(xì)胞內(nèi)凋亡和遷移相關(guān)蛋白的蛋白免疫印跡；B：3組細(xì)胞內(nèi)vimentin相對表達(dá)量；C:3組細(xì)胞內(nèi)caspase-9前體相對表達(dá)量；D：3組細(xì)胞內(nèi)caspase-9剪切體相對表達(dá)量；E:3組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2相對表達(dá)量；F:3組細(xì)胞內(nèi)Bax相對表達(dá)量(*與空白組和陰性對照組比較，P<0.01)圖6 Western blot檢測3組SW780細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控和遷移能力相關(guān)蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步驗證GRP94與膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，我們嘗試將特異性下調(diào)GRP94表達(dá)的siGRP94導(dǎo)入膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中。本研究中，我們選取了GRP94表達(dá)量相對較高的SW780細(xì)胞株接受siGRP94轉(zhuǎn)染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SW780細(xì)胞內(nèi)GRP94表達(dá)下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯上升，而遷移能力則明顯下降。近年來相關(guān)研究也表明，下調(diào)GRP94的表達(dá)可誘導(dǎo)宮頸癌、食管癌、肝癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并抑制其遷移或侵襲能力[14-18]。因此可以認(rèn)為GRP94在維持包括膀胱腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生存及侵襲遷移能力方面發(fā)揮著重要作用。

為探討下調(diào)GRP94影響膀胱腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的可能機(jī)制，我們檢測了SW780細(xì)胞內(nèi)部分凋亡調(diào)控及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，下調(diào)GRP94表達(dá)可誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase-9開始激活，因此可推測下調(diào)GRP94表達(dá)是通過誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入線粒體凋亡途徑從而促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡。同時，我們還發(fā)現(xiàn)SW780細(xì)胞的vimentin表達(dá)下調(diào)，由于vimentin是維持細(xì)胞骨架的重要蛋白,并在腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移過程中發(fā)揮重要作用[19-21]，因此該蛋白的下調(diào)可能是導(dǎo)致SW780細(xì)胞遷移能力下降的重要原因，但目前尚不明確其具體機(jī)制，需進(jìn)一步研究。