GCC mRNA在早期老年直腸癌患者淋巴結(jié)中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

周小青　曾桂芳　楊斌　葉斌　李才勝　曾祥泰

【摘要】 目的：探討早期老年直腸癌淋巴結(jié)中GCC mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系及能否作為判定淋巴隱匿性轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測48例早期老年直腸癌淋巴結(jié)中GCC mRNA表達(dá)水平（GCC mRNA陽性組12例，GCC mRNA陰性組36例），并分析患者的局部復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率、3年無瘤生存率（DFS）、3年總生存率（OS）與不同GCC mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果：GCC mRNA陰性組患者的局部復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更低，3年無瘤生存率更高（P<0.05）。兩組3年總生存率無明顯差異。結(jié)論：早期老年直腸癌淋巴結(jié)中GCC mRNA不同表達(dá)狀態(tài)患者的預(yù)后有差異，GCC mRNA可以作為直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的有效檢測指標(biāo)，可以作為甄別早期老年直腸癌高危患者的可靠分子學(xué)指標(biāo)，有利于高危患者后續(xù)輔助治療的選擇。

【關(guān)鍵詞】 GCC mRNA； 早期； 老年； 直腸癌； 淋巴結(jié)； 預(yù)后

The Relationship between Lymph Node GCC mRNA Expression and Prognosis in Elder Patients of Early Stage Rectal Cancer/ZHOU Xiao-qing，ZENG Gui-fang，YANG Bin，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（06）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the relationship between GCC mRNA expression of lymph nodes and prognosis in elder patients of early stage rectal cancer .Method： The expression of GCC mRNA in lymph nodes of 48 elder patients of early stage rectal cancer were detected by RT-PCR method，they were divided into the GCC mRNA positive group for 12 cases and the negative groups for 36 cases. The relationship between local recurrence， distant metastasis rate， disease-free survival of 3 years （DFS），over-all survival （OS） and GCC mRNA expression levels of the two groups were analyzed.Result： The GCC mRNA negative group had lower local recurrence and distant metastasis rate， disease-free survival of 3 years was higher（P<0.05）.There was no significant difference in the overall survival rate of 3 years between the two groups.Conclusion： Lymph node GCC mRNA expression level is closely related to the prognosis of early stage rectal cancer in elder patients. It can be used as an effective molecular marker in lymph node micrometastase of rectal cancer.

【Key words】 GCC mRNA； Early stage； Elder patients； Rectal cancer； Lymph nodes； Prognosis

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341600，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.06.001

直腸癌是一種常見消化道腫瘤，好發(fā)于中老年患者，隨著社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，環(huán)境污染的加劇，高熱卡、高脂、低素等不良飲食方式及缺乏運(yùn)動等不良生活方式，直腸癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢，我國大中型城市尤為明顯，雖然隨著直腸癌外科TME技術(shù)的推廣及新的化療藥物與放療技術(shù)的發(fā)展，直腸癌的綜合治療取得長足進(jìn)步，但5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50%的患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是直腸癌復(fù)發(fā)的重要因素，早期患者，尤其是老年患者，總體預(yù)后相對較好，但其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率也高達(dá)20%～30%。臨床一般將無淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Ducks A、B期稱為早期直腸癌，對于早期直腸癌患者，是否需要化療，NCCN 指南明確Ducks A期術(shù)后無需化療已成共識，對于Ducks B期患者目前爭議仍很大，主要根據(jù)年齡、病理類型、脈管浸潤與否、有無穿孔、淋巴結(jié)清掃數(shù)目等危因素綜合考慮是否化療，老年患者部分因基礎(chǔ)疾病及高齡，耐受化療相對較差，是否化療仍缺乏共識。早期直腸癌淋巴結(jié)中癌細(xì)胞的隱匿性轉(zhuǎn)移是其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。鳥苷酸環(huán)化酶 C（Guanylyl cyclases C，GCC/GUCYC）是受體鳥苷酸環(huán)化酶家族成員之一，在腸道上皮細(xì)胞高度表達(dá)，普遍過表達(dá)于結(jié)腸直腸癌細(xì)胞（>80%），但在正常淋巴中無表達(dá)，可作為結(jié)直腸癌的特異性標(biāo)志分子[1]。本研究應(yīng)用RT-PCR檢測早期老年直腸癌患者淋巴結(jié)中GCC mRNA的表達(dá)狀態(tài)，并分析患者預(yù)后與不同GCC mRNA表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系，以探討GCC mRNA能否作為一個(gè)判斷淋巴結(jié)微的可靠指標(biāo)及其對直腸癌的分子分期以及預(yù)后判斷的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月-2012年6月本院收住的術(shù)前腸鏡病理證實(shí)為直腸癌的患者，手術(shù)后即刻對標(biāo)本中淋巴結(jié)進(jìn)行解剖，以淋巴結(jié)縱軸為中心切開淋巴結(jié)，一分為二，編號處理，其中一份送病理檢查，另一份留取冰凍保存，待病理回報(bào)后證實(shí)系直腸癌；清掃淋巴結(jié)數(shù)≥12枚且常規(guī)病理淋巴結(jié)為陰性的老年患者，選取對應(yīng)患者的冰凍保存淋巴結(jié)進(jìn)行解凍。共選取48例患者，其中男30例，女18例，年齡（66±5.6）歲，其中低分化腺癌10例，

中-高分化腺癌38例，TNM分期：T1 14例，

T2 16例，T3 10例，T4 8例。

1.2 試劑與方法 （1）實(shí)驗(yàn)方法詳見操作規(guī)范[2-3]。（2）將48例患者根據(jù)PT-PCR檢測GCC mRNA的表達(dá)分為陽性組12例與陰性組36例，對兩組患者進(jìn)行密切隨訪，第1～2年，每3個(gè)月一次，第3年以后，每6個(gè)月一次，隨訪期間常規(guī)體格檢查，并予查血CEA、CA19-9、CA72-4，腹盆腔CT，胸部X-Ray，如癌標(biāo)指標(biāo)升高，常規(guī)腹盆腔CT未發(fā)現(xiàn)病灶時(shí)，予行PET-CT檢查以明確。（3）復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移患者治療：對于局部復(fù)發(fā)者，身體耐受良好，選擇再次手術(shù)切除，而對于患者耐受差或拒絕手術(shù)者，選擇局部放療；對于轉(zhuǎn)移者，如廣泛轉(zhuǎn)移者，選擇mFOLFOX6或XELOX方案，部分患者根據(jù)K-RAS狀況，選擇聯(lián)合C225等單抗治療，如果局灶性肝轉(zhuǎn)移，患者身體耐受良好，選擇手術(shù)轉(zhuǎn)移灶切除，如患者耐受差，筆者選擇TACE或RF治療，局部治療后予FOLFOX6或XELOX方案化療。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組患者的局部復(fù)發(fā)率、3年總生存率、無瘤生存時(shí)間等指標(biāo)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

淋巴結(jié)GCC mRNA陽性表達(dá)組局部復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較陰性組高，3年無瘤生存率較陰性組差（P<0.05）；陰性組3年總生存率略高，但與陽性組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。相同T分期患者淋巴結(jié)GCC mRNA陽性組預(yù)后較陰性組差，陽性組脈管浸潤率較陰性組高，其中T3～4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽性率明顯高于T1～2，見表1～3。

3 討論

直腸癌是一種常見消化道腫瘤，好發(fā)于中老年患者，隨著社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，老齡化進(jìn)程的步入，環(huán)境污染的加劇，高熱卡、高脂、低素等不良飲食方式及缺乏運(yùn)動等，直腸癌的發(fā)病率在逐年增加，尤其在老年患者，成為危害人民生命健康的主要惡性腫瘤之一。隨著各類新的抗腫瘤藥物出現(xiàn)及新技術(shù)進(jìn)展，尤其是1982年Heald教授提出全直腸系膜技術(shù)的應(yīng)用（TME），直腸癌復(fù)發(fā)率由傳統(tǒng)20%～40%下降至5%～10%，TME已成為中低位直腸癌根治術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50% 的患者最終死于直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)及肝轉(zhuǎn)移，其中復(fù)發(fā)以會陰、盆壁、前列腺、陰道、子宮附件、吻合口、直腸周圍組織及直腸系膜淋巴結(jié)多見，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是直腸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的重要原因，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[4-5]；即使是不存在局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期直腸癌患者，在復(fù)發(fā)患者中占比達(dá)20%～30%，如何降低患者的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移成為難點(diǎn)。放化療可降低復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但既往對于早期直腸癌患者是否化療，主要依據(jù)年齡、病理類型、腫瘤浸潤深度、脈管浸潤與否、有無穿孔、淋巴結(jié)清掃數(shù)目等高危因素綜合考慮；然而老年患者，尤其是合并有基礎(chǔ)疾病或高齡患者，化療是否受益仍無共識，準(zhǔn)確識別高?；颊哂葹橹匾渲邪┘?xì)胞在淋巴結(jié)中的隱匿性轉(zhuǎn)移則是導(dǎo)致直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素，目前是研究的熱點(diǎn)[6]。

傳統(tǒng)分期方法主要根據(jù)常規(guī)組織病理學(xué)檢測結(jié)果，其主要缺點(diǎn)是常規(guī)病理僅檢測少數(shù)淋巴結(jié)或僅能檢測一個(gè)淋巴結(jié)的數(shù)個(gè)切面進(jìn)行分析，組織病理學(xué)檢查本身的敏感性相對局限，最高分辨率僅能從200個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞，易遺漏陽性淋巴結(jié)，尤其是對于隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，微轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞數(shù)偏少，容易造成假陰性，有低估患者實(shí)際分期之疑；故常規(guī)病理淋巴結(jié)陰性并不代表淋巴結(jié)沒有腫瘤細(xì)胞浸潤。隨著基因組學(xué)與蛋白組學(xué)等分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR ） 技術(shù)的成熟和完善， 檢測隱匿性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)[7-10]。RT-PCR技術(shù)檢測隱匿性轉(zhuǎn)移的優(yōu)于測定蛋白質(zhì)的免疫學(xué)技術(shù)，主要優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：（1） 技術(shù)更簡便易行，RT-PCR 相對免疫學(xué)技術(shù)易行， 只要待測基因序列， 即可設(shè)計(jì)引物作RT-PCR， 而免疫學(xué)技術(shù)則需不斷生產(chǎn)特異性抗體；（2） 特異性更高，首先有些腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄組織特異性抗原的mRNA ，但無該抗原蛋白合成，其次mRNA 在細(xì)胞外很不穩(wěn)定， 故只要在組織或體液中測出特異性RNA ， 就意味著有腫瘤細(xì)胞的存在，故檢測mRNA特異性更高； （3） 敏感性更高，很少量的癌細(xì)胞即可被檢出，可以檢出約106～107個(gè)正常細(xì)胞中夾雜的一個(gè)腫瘤細(xì)胞，較傳統(tǒng)病理200個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞敏感性更高； （4） 遺漏率低，提取整塊淋巴結(jié)組織的RNA 進(jìn)行檢測， 克服了傳統(tǒng)組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)方法只能切取數(shù)個(gè)淋巴結(jié)切面的缺點(diǎn)； （5） 更為省時(shí)省力，可以同時(shí)對大量標(biāo)本進(jìn)行檢測并且整個(gè)過程只需1～2 d。

GCC是受體鳥苷酸環(huán)化酶家族成員之一，人類GUCYC基因定位于12號染色體[9-11]，約85 kb，有27個(gè)外顯子，含3745 bp核苷酸序列；GUCYG在正常小腸黏膜上皮及直腸惡性腫瘤中表達(dá)，是直腸癌一個(gè)高度特異性的生物學(xué)指標(biāo)[1，11-12]。

本研究利用RT-PCR檢測早期老年直腸癌患者淋巴結(jié)中GCC mRNA的表達(dá)情況，分析不同表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系，淋巴結(jié)GCC mRNA陽性組復(fù)發(fā)2例（16.67%），盆骶復(fù)發(fā)1例，髂血管旁淋巴結(jié)復(fù)發(fā)合并肝轉(zhuǎn)移1例，多發(fā)肝轉(zhuǎn)移1例，淋巴結(jié)GCC mRNA陰性組復(fù)發(fā)2例（5.56%），盆骶復(fù)發(fā)1例，腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例，肝單發(fā)轉(zhuǎn)移1例。淋巴結(jié)GCC mRNA陽性組復(fù)發(fā)率較陰性組高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者復(fù)發(fā)中位時(shí)間多在2年內(nèi)，2年后復(fù)發(fā)率明顯減少；3年無瘤生存期陽性組較陰性組短，相同T分期患者淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽性組預(yù)后較陰性組差，其中T3、T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽性率明顯高于T1、T2；GCC mRNA陽性表達(dá)者預(yù)后差，3年總生存率目前無明顯差異，可能同復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移后采取積極的手術(shù)與化療及靶向治療有關(guān)，其對于5年總生存率有無影響還需進(jìn)一步隨訪觀察，對于GCC mRNA表達(dá)者預(yù)后差，具體機(jī)制還有待探索，可能同GCC mRNA通過cGMP依賴的相關(guān)機(jī)制來調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[13-16]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)，對直腸癌的分子生物學(xué)分期以及預(yù)后判斷有一定指導(dǎo)意義，有可能作為早期老年直腸癌輔助治療的重要參考指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] Lucas K A，Pitari G M，Kazerounian S，et al.Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP[J].Pharmacol Rev，2000，52（3）：375-414.

[2]宗祥云，師英強(qiáng)，孫孟紅，等.鳥苷酸環(huán)化酶C在大腸癌淋巴結(jié)中表達(dá)的意義[J].外科理論與實(shí)踐，2004，9（5）：407-410.

[3] 周小青，歐陽娟，劉曉平，等.pN0直腸癌患者淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（27）：6-8.

[4] Guillem J G，Paty P B，Cohen A M.Surgical treatment of colorectal cancer[J].CA Cancer J Clin，1997，47（2）：113.

[5]李世擁，于波，直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的診斷及治療進(jìn)展[J].中國實(shí)用外科雜志，2004，24（1）：33.

[6]黃成鋼，劉岸，唐敏.Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（21）：23-26.

[7] Hyslop T，Weinberg D S，Schulz S，et al.Occult tumor burden predicts disease recurrence in lymph node-negative colorectal cancer[J].Clin Cancer Res，2011，17（10）：3293-3303.

[8] Chen G，Mclver C M，Texler M，et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patents：a multiple-marker reverse transcriptase polymetase chain reaction study[J].Dis Colon Rectum，2004，47（5）：679-686.

[9]萬遠(yuǎn)廉，潘義生，劉玉村，等.RT-PCR 方法診斷的癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移 [J]. 中國實(shí)用外科雜志，2000，20（1）：47-48.

[10]吳澤建，王惠斌，袁錫裕，等.RT-PCR檢測CK19 mRNA青年結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（7）：6-8.

[11] Lucas K A，Pitari G M，Kazerounian S，et al.Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP[J].Pharmacol Rev，2000，52（3）：375-414.

[12] Frick G S，Pitari G M，Winberg D S，et al.Guanylyl cyclases C：a molecular marker for staging and postoperatative surveillance of patients with colorectal cancer [J].Expret Rev Mol Diagn， 2005，5（5） ：701-713.

[13] Wang R，Kwon I K，Thangaraju M，et al.Type 2 cGMP-dependent protein kinase regulates proliferation and differentiation in the colonic mucosa[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（2）：G209-219.

[14] Basu N， Saha S ， Khan I，et al.Intestinal cell proliferation and senescence are regulated by receptor guanylyl cyclase C and p21[J].J Biol Chem，2014，289（1）：581-593.

[15] Bustin S A，Siddiqi S，Ahmed S，et al.Quantification of cytokeratin 20，carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer，2004，108（3）：412-417.

[16] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2015-10-20） （本文編輯：蔡元元）