涼血止癢合劑對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠IL—10和IFN—γ表達(dá)的影響

楊瑾 楊雪松

摘要：目的 研究涼血止癢合劑對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠IL-10和IFN-γ表達(dá)的影響。方法 通過(guò)涼血止癢合劑對(duì)采用2，4-二硝基氟苯（Dinitrofluobenzene 簡(jiǎn)稱DNFB）造成變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis 簡(jiǎn)稱ACD）小鼠耳廓腫脹模型的影響，觀察其對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠炎癥細(xì)胞的抑制及對(duì)IL-10和IFN-γ表達(dá)的影響。結(jié)果 與模型組比較，涼血止癢合劑組能顯著抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和提高小鼠血清IL-10水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但是對(duì)IFN-γ的產(chǎn)生無(wú)明顯的影響（P>0.05）。結(jié)論 涼血止癢合劑對(duì)小鼠變態(tài)性接觸性皮炎有效，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生和表達(dá)可能是其治療機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：涼血止癢合劑；變應(yīng)性接觸性皮炎；IL-10；IFN-γ；小鼠

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2016）06-0071-03

【Abstract】Objective： To study the effect of Blood-cooling Antipruritic Mixture on IL-10 and IFN-γ expression of allergic contact dermatitis mice. Methods： Blood-cooling Antipruritic Mixture was used to affect 2，4 Dinitrofluobenzene-induced allergic contact dermatitis（ACD）ear swelling mice model and to observe the inhibition of allergic contact dermatitis mouse inflammatory cells and its effect on IL-10 and IFN-γ expression. Results： Compared with the model group，the Blood-cooling Antipruritic Mixture group could significantly inhibit the inflammatory cell infiltration and improve serum IL-10 level in mice. The difference was statistically significant（P<0.05），but IFN-γ generation had no obvious effect（P>0.05）. Conclusion： Blood-cooling Antipruritic Mixture has effect on mice allergic contact dermatitis，and the generation and expression of promoting anti-inflammatory cytokine IL-10 may be one of its therapeutic mechanisms.

【Key words】Blood-cooling Antipruritic Mixture，allergic contact dermatitis，IL-10，IFN-γ，mice

涼血止癢合劑是在本院皮膚科全國(guó)第三批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)劉復(fù)興教授自創(chuàng)的皮內(nèi)2號(hào)方—荊芩湯的基礎(chǔ)上研發(fā)的中草藥復(fù)方制劑（批號(hào)：滇藥制字〈Z〉20081880A號(hào)，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)）。該方主要由荊芥、黃芩、生地黃、牡丹皮、赤芍、紫草6味藥物組成，具有清熱涼血、祛風(fēng)止癢之功，臨床主要用于治療中醫(yī)辨證屬血熱型的接觸性皮炎、化妝品皮炎、特應(yīng)性皮炎、光敏性皮炎等各種皮炎、濕疹及蕁麻疹、藥疹等多種變態(tài)反應(yīng)性皮膚病[1]。涼血止癢合劑臨床療效顯著，具有明顯抗炎止癢的作用，且無(wú)明顯毒副作用，然而其抗炎的作用機(jī)理，通過(guò)何種途徑發(fā)揮作用，都尚不明確。本研究通過(guò)建立2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致的小鼠耳廓腫脹模型，觀察涼血止癢合劑對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠炎癥細(xì)胞的抑制及對(duì)IL-10和IFN-γ表達(dá)的影響[2～3]，從組織病理及分子生物學(xué)方面闡述其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)；同時(shí)通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察涼血止癢合劑的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 昆明種小白鼠，清潔級(jí)，40只，雌雄各半，體重18-22 g，合格證號(hào)：SCXK（滇）2005-0008；合格證號(hào)：0013106，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 涼血止癢合劑（批號(hào)：滇藥制字〈Z〉20081880A號(hào)），100mL/瓶，云南省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑。醋酸地塞米松片（0.75mg/片，浙江仙琚制藥股份公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H33020822，批號(hào)：130644）。0.9%氯化鈉注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字：H52020069，250mL/瓶，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司出品，批號(hào)A13061504）。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒、小鼠IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒（深圳晶美生物有限公司提供）；2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武漢福鑫化工有限公司，批號(hào)：201206012，分析純。顯微鏡、酶標(biāo)儀，電子天平，電動(dòng)剃毛器等。

1.3 給藥劑量

1.3.1 涼血止癢合劑劑量 涼血止癢合劑生藥含量為79 g/100mL，經(jīng)人和動(dòng)物的等效劑量系數(shù)換算，標(biāo)準(zhǔn)體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg。

1.3.2 醋酸地塞米松片給藥劑量[4] 小鼠給藥劑量為0.01 g/kg。

1.3.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)給藥劑量 涼血止癢合劑分別一次給藥劑量為200mg/kg。

1.3.4 主要試劑配制 以4∶[KG-*2]l的丙酮：橄欖油配成0.5%、0.2%兩種濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 涼血止癢合劑對(duì)2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥與造模[4] 健康昆明種小鼠，30只，雌雄各半，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分成3組，分別為模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（醋酸地塞米松組），涼血止癢合劑組。除模型組給予等體積生理鹽水外，陽(yáng)性藥組醋酸地塞米松組每日給藥量為0.01 g體重[4]，按照人和動(dòng)物的等效劑量系數(shù)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg，共給藥7d。實(shí)驗(yàn)前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃須刀去毛。實(shí)驗(yàn)第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μL，第3、4、5天不涂藥，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20μl涂抹在小鼠左耳兩面進(jìn)行免疫攻擊。右耳單涂丙酮∶橄欖油（4∶[KG-*2]1）溶劑作為對(duì)照；涂耳24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳。

2.1.2 觀察指標(biāo)

2.1.2.1 病理變化及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)[5] 處死小鼠后，耳部皮損組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE 常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組病理變化，并用網(wǎng)型目鏡測(cè)微尺計(jì)數(shù)單位面積真皮層最密集炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)的多形核細(xì)胞及單一核細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mm2）。

2.1.2.2 檢測(cè)血清IL-10、IFN-γ水平[5] 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘除小鼠眼球，眼眶內(nèi)取血，抗凝血在4℃下3000 r/min離心30 min，獲取血漿，利用ELISA檢測(cè)血漿中IL-10、IFN-γ的濃度。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 目的 觀察涼血止癢合劑的毒副作用。

2.2.2 方法 取18～22 g小鼠20只，雌雄各半，分別一次給藥涼血止癢合劑200 mg/kg，觀察7d內(nèi)動(dòng)物死亡數(shù)，處死后解剖觀察臟器有無(wú)病變。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均使用（x±s）表示。兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料比較若呈正態(tài)分布，并具有總體方差齊性，則采用t檢驗(yàn)，若不具有總體方差齊性，則使用t檢驗(yàn)。2組以上數(shù)據(jù)比較若具有總體方差齊性則采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；2組以上數(shù)據(jù)比較若不具有總體方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，兩兩比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)方法，均以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 涼血止癢合劑對(duì)2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響，見表1，表2。

3.2 急性毒性試驗(yàn) 對(duì)照組和涼血止癢合劑組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血止癢合劑無(wú)毒副作用，安全有效。

4 討論

在炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子可分為5類[1]：①調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞激活、增值、分化的細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4、IL-10；②調(diào)節(jié)自然免疫的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IFN-α；③激活巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，包括IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-5、IL-10、IL-12；④對(duì)各種炎細(xì)胞的化學(xué)趨化因子；⑤刺激造血的細(xì)胞因子。其中IL-10是免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能減少LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)抗炎介質(zhì)如可溶性TNFR的釋放，還可抑制CD4+T細(xì)胞的增值和細(xì)胞因子的分泌，包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5，同時(shí)還可抑制中性粒細(xì)胞合成和釋放促炎介質(zhì)[6]。IFN-γ屬于激活巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)加重炎癥[1]。

涼血止癢合劑和醋酸地塞米松連續(xù)灌胃給藥7天后，組織學(xué)檢查顯示涼血止癢合劑和地塞米松均可明顯抑制小鼠右耳中單—核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和充血水腫，2組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），但涼血止癢合劑組和陽(yáng)性對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說(shuō)明涼血止癢合劑與醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用，但涼血止癢合劑的抗炎作用并不優(yōu)于醋酸地塞米松。

在細(xì)胞因子IL-10的研究中，與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥地塞米松和涼血止癢合劑藥物均顯著提高具有免疫抑制活性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生水平，差異均有顯著性意義（P<0.05），但陽(yáng)性對(duì)照組與涼血止癢合劑組比較，差異不顯著（P>0.05）；說(shuō)明地塞米松和涼血止癢合劑均通過(guò)提高具有免疫抑制活性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生水平來(lái)達(dá)到抗炎的作用，但涼血止癢合劑并不優(yōu)于醋酸地塞米松。對(duì)于IFN-γ的影響研究中，與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥地塞米松組IFN-γ產(chǎn)生顯著減少，差異有顯著性意義（P<0.01），然而涼血止癢合劑對(duì)小鼠細(xì)胞因子IFN-γ產(chǎn)生無(wú)明顯的影響（P>0.05），說(shuō)明地塞米松通過(guò)降低IFN-γ的水平，進(jìn)而發(fā)揮抗炎癥作用，但涼血止癢合劑對(duì)IFN-γ水平的影響不顯著。

通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，對(duì)照組和涼血止癢合劑組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血止癢合劑無(wú)毒副作用，安全有效。

涼血止癢合劑臨床應(yīng)用已十多年，并在云南中醫(yī)醫(yī)療集團(tuán)20余家醫(yī)院廣泛使用，臨床療效顯著，具有明顯抗炎止癢的作用，且無(wú)明顯毒副作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其組方中的黃芩、丹皮、赤芍、紫草、荊芥均有一定的抗炎作用，對(duì)I、II、III和Ⅳ變態(tài)反應(yīng)均有抑制作用，對(duì)白介素、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平均有影響[7～8]，為組方的合理性提供了一定現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，但中藥復(fù)方通常作用于機(jī)體多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)，是個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，故有必要進(jìn)一步深入研究，闡明其抗炎的作用機(jī)制，并通過(guò)急性毒性試驗(yàn)從科學(xué)角度驗(yàn)證其毒副作用。

通過(guò)以上的研究表明，涼血止癢合劑具有較為明確的抗炎作用，其抗炎作用可能與提高細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生水平有關(guān)，且無(wú)毒副作用，安全有效。不僅為其它變態(tài)反應(yīng)參與的皮膚病的防治開拓新的思路，同時(shí)為名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的應(yīng)用推廣提供了科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步挖掘及研究名老中醫(yī)學(xué)術(shù)思想和臨床經(jīng)驗(yàn)提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙辨.中國(guó)臨床皮膚病學(xué)[M].4版.南京：江蘇科技出版社，2010：95-97，140，717-760.

[2]李敏.疏風(fēng)飲對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及IFN-γ與IL-4分泌的影響[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，25（1）：24-25.

[3]任興斌，諸葛寶忠，季海生.濕疹患者外周血CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和血清IL-4，IL-10，TGF-β檢測(cè)及臨床研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（3）：131-133.

[4]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：28.

[5]蘇向陽(yáng)，季雙雙，賴維.變應(yīng)性接觸性皮炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志，2011，37（3）：158-160.

[6]朱平，杜小萍，鞠吉雨.IL-10與疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志，2012，35（1）：14-17.

[7]楊正生，楊會(huì)君，王亞斐，等.丹皮酚對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎Th1/Th2分子表達(dá)的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（12）：914-917.

[8]劉欣，李萍，趙京霞，等.涼血活血膠囊全方及拆方對(duì)Jurkat T淋巴細(xì)胞增殖、活化及釋放細(xì)胞因子的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（22）：198-202.

（收稿日期：2016-03-28）