呋喃妥因代謝物化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究

王 瑞，呂月霞，黃登宇?，王云貴，李 濤

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006；2.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，深圳518101；3.山西先鋒科技開(kāi)發(fā)有限公司，太原030006）

呋喃妥因代謝物化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究

王 瑞1，呂月霞1，黃登宇1?，王云貴2，李 濤3

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006；2.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，深圳518101；3.山西先鋒科技開(kāi)發(fā)有限公司，太原030006）

對(duì)呋喃妥因代謝物1－氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）進(jìn)行半抗原改造，采用活化酯法將半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)為包被原，與標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)AHD單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，建立了AHD間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫（CLEIA）檢測(cè)法，并對(duì)化學(xué)發(fā)光液、包被原與抗體最優(yōu)稀釋度、包被條件、封閉液和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間五項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：該方法具有良好的特異性，IC50為0.753 ng／mL，在雞肉組織中的檢測(cè)限為0.028 μg／kg，添加回收率在80.54%～102.64%之間，變異系數(shù)均小于10%。與國(guó)標(biāo)中液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）和我國(guó)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）相比，不僅降低了檢測(cè)限，而且操作簡(jiǎn)便，為動(dòng)物源性食品中呋喃妥因代謝物的殘留提供了準(zhǔn)確、便捷的分析檢測(cè)手段。

呋喃妥因代謝物；包被原；化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)

近年來(lái)，動(dòng)物源性食品中獸藥殘留問(wèn)題給人體帶來(lái)的毒性、致癌致畸性、耐藥性和過(guò)敏反應(yīng)等危害，已引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注［1］。硝基呋喃類(lèi)藥物對(duì)絕大多數(shù)革蘭氏菌均有抑菌殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于治療水產(chǎn)、畜禽等動(dòng)物傳染病和胃腸道感染。但是，毒理學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物具有強(qiáng)毒性和致癌性作用［2］。因此，對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的分析和檢測(cè)具有重要意義。呋喃妥因是硝基呋喃類(lèi)藥物之一，目前對(duì)呋喃妥因代謝物1－氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）的檢測(cè)主要是儀器分析法［3］，也有少數(shù)采用酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)法［4－5］。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（CLEIA）將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的高靈敏度與ELISA的高特異性相結(jié)合［6］，在靈敏度和最低檢測(cè)限方面有所突破，且與儀器分析法相比，不需要昂貴的設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短，適用于大量樣本快速篩查，對(duì)嚴(yán)把食品安全質(zhì)量關(guān)有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立了AHD CLEIA法，并對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化和評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 AHD單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗（HRP－IgG）（北京艾旗斯德科技有限公司提供）；1－氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）、二甲基甲酰胺（DMF）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N－二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、卵清蛋白（OVA）、魯米諾、對(duì)甲苯酚、1－（2－硝基苯亞甲基）－氨基乙內(nèi)酰脲（NPAHD）、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基硅烷（TMS）（Sigma公司）；對(duì)碘苯酚、過(guò)氧化氫脲、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、對(duì)醛基苯甲酸（4－CBA）、30%雙氧水（30%H2O2）、甲醇（CH3OH）、乙醇（C2H5OH）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；透析袋（Solarbio公司）；96孔化學(xué)發(fā)光板（Thermo Fisher Sicentific公司）；其他有關(guān)化學(xué)試劑均為分析純。

BSA224S電子天平（精度0.1 mg）（德國(guó)Sartorius公司）；單道微量移液器0.5～10 μL、10～100 μL（美國(guó)Thermo公司）；8通道移液器30～300 μL（德國(guó)Eppendorf公司）；1000～5000 μL移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；UPT－I－10T超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；VORTEX GENIUS3混勻儀、RH BASIC1加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；BSD－100振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；SC－3610低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；UV－1600PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；INFINITE 200PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；AVANCE 600MHZ超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成半抗原1－（4－羧基苯亞甲基）－氨基乙內(nèi)酰脲（CPAHD） 76.0 mg AHD溶于8.0 mL CH3OH，滴加到10.0 mL溶有75.0 mg 4－CBA的CH3OH溶液中，65℃攪拌18 h，4500 r／min離心5 min，棄上清，C2H5OH洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后吹干，得白色粉末狀固體［7］。核磁共振氫譜（1HNMR）驗(yàn)證CPAHD合成是否成功。

1.2.2 制備包被原CPAHD－OVA 5.0 mg CPAHD溶于 250 μL DMF，加入3.6 mg NHS和 6.8 mg DCC，室溫下反應(yīng)14 h，得活化反應(yīng)產(chǎn)物A液；取5.4 mg OVA溶于 1.3 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol／L，pH 7.4），得B液；將A液緩慢加入B液，室溫反應(yīng)2 h，4℃攪拌過(guò)夜（12 h）。PBS透析96 h，4500 r／min離心5 min，棄沉淀，上清液冷凍干燥，得白色固體［7－8］。

1.2.3 AHD化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)法操作步驟包被原 CPAHD－OVA用碳酸鹽緩沖液（CBS，0.05 mol／L，pH 9.6）稀釋后加入到96孔化學(xué)發(fā)光板，100 μL／well，包被一定時(shí)間；200 μL／well磷酸鹽洗滌液（PBST，0.01 mol／L，0.05%吐溫－20，pH 7.4）洗板甩干，加入200 μL／well封閉液，37℃封閉2 h，洗板；每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品NPAHD溶液或樣品溶液50 μL和50 μL抗體，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)一定時(shí)間，洗板；加稀釋4000倍的HRP－IgG，100 μL／well，37℃孵育1.5 h，洗板；加化學(xué)發(fā)光液100 μL／well，室溫下避光反應(yīng)數(shù)分鐘，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度RLU［9］。

1.2.4 優(yōu)化CLEIA參數(shù) 影響CLEIA高靈敏度的參數(shù)很多，每個(gè)參數(shù)的改變都可能直接影響檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致靈敏度和重復(fù)性下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響較大的五項(xiàng)參數(shù)包括化學(xué)發(fā)光液、包被原與抗體最優(yōu)稀釋度、包被條件、封閉液和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.1 優(yōu)化化學(xué)發(fā)光液 取44.3 mg魯米諾溶于1.0 mL DMF，配成0.25 mol／L原液；取33.0 mg對(duì)碘苯酚溶于15.0 mL DMF，配成0.01 mol／L原液；取10.8 mg對(duì)甲苯酚溶于 10.0 mL DMF，配成0.01 mol／L原液；取28.2 mg過(guò)氧化氫脲溶于1.0 mL超純水，配成0.30 mol／L原液；將30%H2O2臨用前用PBS稀釋成0.10 mol／L原液；配制1.00 mol／L， pH 8.8的Tris－HCl緩沖液作為化學(xué)發(fā)光底物緩沖液。分別配制8組不同的化學(xué)發(fā)光液組合，如表1所示。

表1 化學(xué)發(fā)光液組合

將50 μL稀釋度為1∶30000的HRP－IgG加入到化學(xué)發(fā)光板中，再加100 μL化學(xué)發(fā)光液（現(xiàn)用現(xiàn)配），每組設(shè) 5個(gè)平行，室溫下避光反應(yīng)，每隔3 min測(cè)定一次RLU值，測(cè)10組，選取RLU值高且發(fā)光穩(wěn)定的組別為最優(yōu)化學(xué)發(fā)光液組合［10］。

1.2.4.2 優(yōu)化包被原與抗體稀釋度 采用棋盤(pán)法確定包被原和抗體的最優(yōu)稀釋度。將包被原按1∶1250，1∶2500，1∶5000，1∶10000，1∶20000，1∶40000的稀釋度作縱向包被，AHD單克隆抗體按1∶10000，1 ∶20000，1 ∶40000，1 ∶80000，1∶160000，1∶320000，1∶640000，1∶1280000的稀釋度作橫向包被，HRP－IgG濃度為1∶4000，競(jìng)爭(zhēng)抑制藥物NPAHD濃度為100 ng／mL，測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度RLU，確定最優(yōu)結(jié)果。

1.2.4.3 優(yōu)化包被條件 以最佳包被原稀釋濃度包被，100 μL／well，分別設(shè)置4℃包被過(guò)夜（1組）、37℃包被2 h再4℃包被過(guò)夜（2組）和37℃包被2 h（3組）3種包被條件，確定最優(yōu)，每組設(shè) 3個(gè)平行。

1.2.4.4 優(yōu)化封閉液 以上述最優(yōu)包被原、抗體稀釋度和包被時(shí)間為基礎(chǔ)，分別設(shè)置1%脫脂乳粉（1組）、1%明膠（2組）和1%BSA（3組）3種不同封閉液，確定最優(yōu)，每組設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4.5 優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間 分別設(shè)置40 min、1 h、2 h、2.5 h 4組競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間，確定最優(yōu)，每組設(shè)3個(gè)平行。

1.2.5 CLEIA方法學(xué)評(píng)估

1.2.5.1 建立CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線 將標(biāo)準(zhǔn)品NPAHD配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng／mL系列濃度梯度溶液，每個(gè)濃度3個(gè)平行，按照1.2.3項(xiàng)步驟及上述優(yōu)化后最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行操作，測(cè)定RLU值。以B／B0（B為各濃度NPAHD抑制時(shí)RLU值，B0為無(wú)NPAHD抑制時(shí)RLU值）為縱坐標(biāo)，NPAHD濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程及該方法靈敏度IC50，其中IC50為NPAHD 50%抑制濃度。

1.2.5.2 測(cè)定特異性 CLEIA方法特異性通過(guò)交叉反應(yīng)率CR來(lái)反映。將NPAHD結(jié)構(gòu)類(lèi)似物呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、呋喃唑酮代謝物（AOZ）、呋喃它酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（SEM）及其對(duì)應(yīng)的代謝物衍生物NPAOZ、NPAMOZ、NPSEM和衍生試劑4－CBA、鄰硝基苯甲醛分別配制成 100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng／mL系列濃度，按照1.2.3項(xiàng)所述步驟檢測(cè)，計(jì)算其各自 IC50。交叉反應(yīng)率 CR（%）＝IC50（NPAHD）／IC50（類(lèi)似物）×100%。

1.2.5.3 測(cè)定準(zhǔn)確性和精密度 CLEIA方法的準(zhǔn)確性以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。本實(shí)驗(yàn)對(duì)空白雞肉樣品進(jìn)行AHD標(biāo)準(zhǔn)品添加回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度分別為1、5、15 ng／g，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，并分批進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)。

取1.0 g雞肉組織，加入4.0 mL超純水，勻漿，再加入1.00 mol／L HCl 0.5 mL和0.01 mol／L鄰硝基苯甲醛100 μL，充分混勻，置于37℃振蕩反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.10 mol／L K2HPO45.0 mL，1.00 mol／L NaOH 0.4 mL和5.0 mL乙酸乙酯，室溫下振蕩1 min，4500 r／min離心10 min。取上清液于10 mL離心管中，45℃吹干，然后用1.5 mL正己烷溶解干燥物，再加入0.5 mL PBS溶液，室溫4500 r／min離心10 min，取底部水相用CLEIA方法測(cè)定?；厥章剩?）＝加標(biāo)后實(shí)際測(cè)定值／已知加標(biāo)量×100%。

1.2.5.4 測(cè)定最低檢測(cè)限 取空白雞肉樣品20份進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的樣品濃度。以20份空白樣品濃度平均值（）加3倍標(biāo)準(zhǔn)差（s）作為樣品檢測(cè)的最低檢測(cè)限（LOD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原CPAHD的鑒定 對(duì)CPAHD進(jìn)行1HNMR掃描，分析圖譜可知，CPAHD，1HNMR（DMSO，20℃，δvs.TMS）4.381（s，2H，CH2），7.803－7.817（m，2H，C6H），7.862（s，1H，CH＝），8.003－8.017（m，2H，C6H），11.303－11.336（m，1H，NH），13.086（s，1H，COOH）。其中7.862（s，1H，CH＝）證明CPAHD已合成。

2.2 包被原CPAHD－OVA的紫外鑒定 參考文獻(xiàn)［11］對(duì)包被原CPAHD－OVA進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描，分析圖譜可知，CPAHD在299 nm處有吸收峰，OVA在 279 nm處有吸收峰，CPAHD－OVA在303 nm處有吸收峰。說(shuō)明CPAHD與OVA偶聯(lián)后，吸收峰發(fā)生了明顯偏移，初步判斷包被原偶聯(lián)成功。

2.3 優(yōu)化CLEIA參數(shù)

2.3.1 優(yōu)化化學(xué)發(fā)光液 8組化學(xué)發(fā)光液測(cè)得RLU值如圖1，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)甲苯酚作化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑時(shí)，RLU值較對(duì)碘苯酚穩(wěn)定，但RLU值卻比對(duì)碘苯酚小1個(gè)數(shù)量級(jí)左右。第2組，對(duì)碘苯酚作發(fā)光增強(qiáng)劑，過(guò)氧化氫脲作氧化劑，6 min內(nèi)，RLU值穩(wěn)定在1900000左右，滿(mǎn)足RLU值高且穩(wěn)定的要求，故選擇第2組作為化學(xué)發(fā)光液組合，檢測(cè)時(shí)間選擇4 min。

圖1 不同化學(xué)發(fā)光液組合對(duì)應(yīng)的RLU值

2.3.2 優(yōu)化包被原與抗體稀釋度 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)中，通過(guò)考察不同反應(yīng)條件下B／B0的比值，優(yōu)選包被原與抗體的最適稀釋度。B／B0越小，靈敏度越高；適當(dāng)增大包被原或抗體稀釋度，可提高反應(yīng)靈敏度［12］。棋盤(pán)測(cè)定結(jié)果如表2，綜合考慮，選擇包被原稀釋度為 1∶10000，抗體稀釋度為1∶160000。此外，B／B0值的差異說(shuō)明加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物NPAHD后，包被原與抗體結(jié)合反應(yīng)發(fā)生了不同程度抑制，進(jìn)一步證明包被原偶聯(lián)成功。

表2 不同包被原和抗體稀釋度下B／B0值

2.3.3 優(yōu)化包被條件 將不同包被條件下測(cè)得結(jié)果，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC50和RLUmax／IC50，RLUmax為最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2。第2組37℃包被2 h再4℃包被過(guò)夜的包被條件下，RLUmax／IC50最大，說(shuō)明此條件下，靈敏度最高［8］。表明先在37℃條件下包被，溫度較高有助于包被原在酶標(biāo)板上快速吸附，再4℃包被過(guò)夜，較長(zhǎng)時(shí)間可使包被原包被均勻，提高靈敏度。

圖2 包被條件優(yōu)化

2.3.4 優(yōu)化封閉液 不同封閉液所得 IC50和RLUmax／IC50結(jié)果如圖3，脫脂乳粉和BSA的IC50接近，均低于明膠IC50，但是脫脂乳粉的RLU值偏低，以至于其RLUmax／IC50偏小，BSA RLUmax／IC50最大。說(shuō)明BSA封閉時(shí)，靈敏度最高。BSA作為一種蛋白類(lèi)封閉物，其降低非特異性吸附的性能優(yōu)于脫脂乳粉和明膠。

2.3.5 優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間 不同競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間所得IC50和RLUmax／IC50結(jié)果如圖4，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)1 h，RLUmax／IC50值最大，靈敏度最高，此后IC50趨于穩(wěn)定，變化不明顯，RLUmax／IC50值有所降低。表明抑制物與抗體競(jìng)爭(zhēng)性與包被原結(jié)合反應(yīng)1 h后，反應(yīng)基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 封閉液優(yōu)化

圖4 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間優(yōu)化

2.4 CLEIA方法學(xué)評(píng)估

2.4.1 建立CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線 IC50是評(píng)價(jià)CLEIA方法靈敏度的重要指標(biāo)，其值越小，說(shuō)明此方法靈敏度越高。以?xún)?yōu)化后各參數(shù)為實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行CLEIA系列標(biāo)品濃度競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，即包被原稀釋度1∶10000，先37℃包被2 h再4℃包被過(guò)夜；以1% BSA為封閉液；抗體稀釋度1∶160000；競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間1 h；化學(xué)發(fā)光液以對(duì)碘苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑，過(guò)氧化氫脲為氧化劑，其中魯米諾、對(duì)碘苯酚和過(guò)氧化氫脲的摩爾比為5∶7∶3，加入化學(xué)發(fā)光液后避光反應(yīng)4 min，測(cè)定RLU值。得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。在0.042～15.521 ng／mL范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，可進(jìn)行精確檢測(cè)，線性方程為Y＝－23.911X＋118.78，R2＝0.9917，得出IC50為0.753 ng／mL，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的AHD CLEIA檢測(cè)法靈敏度較高。

圖5 AHD CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4.2 測(cè)定特異性 CLEIA法特異性測(cè)定結(jié)果如表3，抗體除對(duì)呋喃妥因原藥存在24.80%的交叉反應(yīng)外，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物及衍生試劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。由于呋喃妥因原藥在進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，迅速代謝分解，故在實(shí)際樣本檢測(cè)中，其內(nèi)并不含呋喃妥因原藥與抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。說(shuō)明本方法所用的AHD單克隆抗體具有良好的特異性，用于樣品檢測(cè)時(shí)，可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中是否有呋喃妥因代謝物。

表3 特異性測(cè)定結(jié)果表

2.4.3 測(cè)定準(zhǔn)確性和精密度 本實(shí)驗(yàn)向空白雞肉樣品組織中添加了3組不同濃度水平的AHD，通過(guò)鄰硝基苯甲醛衍生化，成為抗體識(shí)別物。CLEIA法測(cè)定各濃度水平添加回收率，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，并分批進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表 4，回收率在80.54%～102.64%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。說(shuō)明建立的CLEIA法準(zhǔn)確性和精密度良好，可以滿(mǎn)足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求。

2.4.4 測(cè)定最低檢測(cè)限 對(duì)20份空白雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的樣品濃度，如表5。20份空白樣品濃度平均值為0.013 μg／kg，標(biāo)準(zhǔn)差為0.005，最低檢測(cè)限（LOD）為0.028 μg／kg。

表4 準(zhǔn)確性和精密度測(cè)定結(jié)果表

表5 最低檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果表

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立了呋喃妥因代謝物AHD化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，并對(duì)化學(xué)發(fā)光液、包被原與抗體最優(yōu)稀釋度、包被條件、封閉液和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間五項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，該方法靈敏度IC50為0.753 ng／mL，最低檢測(cè)限達(dá)0.028 μg／kg。其最低檢測(cè)限遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)［13］中液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）檢測(cè)限0.5 μg／kg和我國(guó)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［14］中ELISA法檢測(cè)限0.1 μg／kg，因而更加符合動(dòng)物源性食品中AHD不得檢出的高靈敏度檢測(cè)要求［15］，對(duì)于嚴(yán)格監(jiān)控AHD殘留、嚴(yán)把食品安全質(zhì)量關(guān)、保障食品安全具有重要參考價(jià)值。此方法精密度、準(zhǔn)確性和特異性良好，是下一步研制AHD化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)，以滿(mǎn)足大批量樣本快速篩查的需求，為基層食品安全監(jiān)管人員檢測(cè)AHD殘留量提供一種準(zhǔn)確、可靠、便捷的方法，有利于迅速控制食品安全風(fēng)險(xiǎn)，保障人民群眾飲食健康安全。

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［14］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局SN／T 3380－2012.出口動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法［S］.

［15］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào).動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［Z］.

（編 輯：侯向輝）

Study of Chemiluminescent Enzyme Immunoassay Method for Nitrofurantoin Metabolite

WANG Rui1，LV Yue－xia1，HUANG Deng－yu1?，WANG Yun－gui2，LI Tao3
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan030006，China；2.Shenzhen Bioeasy Technology Inc.，Shenzhen518101，China；3.Shanxi Vanguard Technology Co Ltd.，Taiyuan030006，China）

The haptene of nitrofurantoin metabolite（AHD）was modified by hapten，then made it conjugate with ovalbmin（OVA） by using N－h(huán)yduoxysuccinimide ester method to synthesize envelope antigen.Then the compound was coupled to AHD monoclonal antibody competitively with standard reference.After the HRP labeled goat－anti－mouse secondary antibody coupled to the monoclonal antibody which conjugated with envelope antigen，an indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay（CLEIA）for AHD was established.Then five test parameters，such as chemiluminescent solution，envelope antigen concentration and antibody concentration，enveloped condition，sealed liquid and competitive reaction time were optimized.The results indicated that the AHD CLEIA had good specificity for AHD.We obtained an IC50value of 0.753 ng／mL.We also obtained the limit of detection of 0.028 μg／kg and recoveries rates of AHD ranged from 80.54%to 102.64%in spiked chicken samples.The coefficient of variation was less than 10%.Compared with LC－MS／MS in national standards and ELISA in industry standard for CIQ，this method not only improved the detection limit，but also operated easily.It could provide a convenient and accurate way for detection of AHD，which will have great value for the evaluation of food safety.

nitrofurantoin metabolite；envelope antigen；CLEIA

2015－02－10

A

1002－1280（2015）04－0035－07

S859.79

王 瑞，碩士研究生，從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。

黃登宇。E－mail：Huangdy110＠126.com