青島地區(qū)鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定

遲夢宇 錢恒偉 趙穎 黃金光

摘要：2015年鵝掌柴炭疽病在青島地區(qū)發(fā)病嚴重，發(fā)病率達50%。本研究從青島城陽區(qū)采集鵝掌柴炭疽病病葉，采用組織分離法對病原菌進行分離，結合形態(tài)學觀察與分子生物學方法對其進行鑒定。結果表明，引起青島地區(qū)鵝掌柴炭疽病的病原菌是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.）。此病原菌引起的鵝掌柴炭疽病在山東省是首次報道。

關鍵詞：鵝掌柴炭疽病菌；膠孢炭疽菌；形態(tài)特征；分子鑒定

中圖分類號：S436.8+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0092-03

鵝掌柴（Schefflera actinophylla [Endl.] Harms）俗名大葉傘，隸屬五加科，鵝掌柴屬，是一種深受人們喜愛的常綠觀葉木本花卉植物，可用于花園、花壇、道路綠化或者作為盆栽置于庭院和室內觀賞。鵝掌柴原產于大洋洲、我國廣東、福建等亞熱帶雨林，日本、越南、印度也有分布，現廣泛種植于世界各地。但是，鵝掌柴在繁殖和栽培種植時常會發(fā)生病害，大大影響其觀賞價值。對鵝掌柴的病原真菌，美國記載了15種[1]。在我國，2003年，習平根等[2]調查鑒定了廣東省鵝掌柴12種真菌病害及其病原菌，其中以葉疫病和炭疽病危害較重。2012年，黃江華等[3]對廣東省鵝掌柴炭疽病病原菌進行鑒定。2015年，鵝掌柴炭疽病在青島地區(qū)發(fā)病嚴重，發(fā)病率高達50%。為有效防控鵝掌柴炭疽病，筆者用病原形態(tài)學及分子生物學方法研究青島市鵝掌柴炭疽病病原菌，為該病的綜合治理提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1供試材料2015年11月采集青島城陽地區(qū)的鵝掌柴炭疽病病葉，并對其進行分離純化。

1.1.2試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；75%乙醇（化學純）；0.1%升汞溶液；無菌水。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化與培養(yǎng)采用組織分離法對鵝掌柴病葉上的病原菌進行分離。于病健交界處切取病組織長度為4～5 mm的小塊，置于75%乙醇中浸泡5 s，接著移入0.1%升汞溶液中浸泡3～5 min，無菌水漂洗3遍，最后將病組織移到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d[4]。

從邊緣挑取病原菌菌絲于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中進行純培養(yǎng)，4 d后挑取純培養(yǎng)菌絲至斜面保存。

1.2.2致病性接種及再分離挑取3片健康鵝掌柴葉片，用無菌水清洗葉片表面并用酒精消毒。用滅菌針將葉片刺傷，再接種病原菌塊，將接好菌的葉片放在盛有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)病情況，以無菌PDA接種作為陰性對照。從接種的發(fā)病組織上再次分離純化病原菌。

1.2.3病原菌形態(tài)觀察用1 mL無菌水反復沖洗PDA上的分生孢子以獲得濃度為104個/mL的孢子懸浮液，用滅菌接種針挑取少量菌絲置于滅菌載玻片上，用挑針挑取培養(yǎng)基內部的菌核放在滴有無菌水的載玻片上，在Olympus BX53顯微鏡下觀察病原菌的菌核、菌絲、分生孢子梗和分生孢子特征并拍攝形態(tài)圖，測量分生孢子大小。

1.2.4病原菌rDNA-ITS序列測定采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[5]，用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[6]（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應體系為25 μL，反應液為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，引物（ITS1和ITS4）各1 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴增程序：94℃預變性 5 min ；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72℃總延伸 10 min。在質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上檢測PCR結果，產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并進行BLAST同源性對比。

2結果與分析

2.1鵝掌柴炭疽病癥狀

發(fā)病初期，病斑從枝干中間向上向下發(fā)展，沿著葉脈侵染葉片，病斑近橢圓形，灰白色，形狀規(guī)則至不規(guī)則形。在環(huán)境陰濕的情況下病斑不斷擴展成水澤狀墨綠色病塊，發(fā)病嚴重的植株整條枝干和葉片均成墨綠色，枝干橫切后內部也都變成墨綠色至黑褐色。后期病斑上可見黑色小點，為病原菌的分生孢子盤，濕度大時病部可產生大量的粉紅色粘孢團（圖1）。

2.2病原菌形態(tài)觀察

在PDA培養(yǎng)基上，鵝掌柴炭疽病病原菌菌落白色至灰白色，邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達，后期產生菌核可長至培養(yǎng)基內。病原菌分生孢子梗無色，具隔膜；分生孢子無色，單孢，長橢圓形至圓柱形，較直，大小為（13.3～18.4） μm×（3.8～5.6）μm（圖2）。根據形態(tài)結果初步判定病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.3rDNA-ITS序列分析

應用真菌18S～28S rDNA間隔區(qū)序列的通用引物ITS1和ITS4，從病原菌基因組DNA中PCR擴增到一條約500 bp的片段（圖3）。測序結果表明，該片段長547 bp（登錄號：KU820630），將其在GenBank中進行同源比較分析，BLAST比對結果表明，該菌株的rDNA-ITS序列與已報道的C. gloeosporioides菌株（KT582155、KT582183）的序列相似性為99%。分子鑒定進一步證實該病原菌為Colletotrichum gloeosporioides。

3討論與結論

鵝掌柴炭疽病是危害鵝掌柴的主要病害之一，在美國、中國廣東省都有過報道。近年來，隨著國內外花卉貿易的發(fā)展，青島市從廣東、云南等省市引種大量鵝掌柴。鵝掌柴炭疽病在青島地區(qū)發(fā)病也日漸嚴重，影響了鵝掌柴的觀賞價值，嚴重的引起植株死亡，造成較大經濟損失。為有效防控鵝掌柴炭疽病，本研究對其病原菌進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，證實青島鵝掌柴炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），對該地區(qū)鵝掌柴炭疽病的防治具有重要意義。該病原菌是炭疽屬內最大的一個種群，其分布非常廣泛，在海南、臺灣、廣東、廣西、湖北、福建、山東等地均有分布，危害寄主近300種，可引起芒果、香蕉、葡萄、龍眼、萬年青、七葉樹等多種植物的炭疽病。炭疽病菌在潮濕環(huán)境下發(fā)病重，所以在福建、廣東、海南等地區(qū)鵝掌柴炭疽病發(fā)病較重。

參考文獻：

[1]Farr D F， Bills G F， Chamuris G P， et al. Fungi on plants and plant products in the United States[M]. Minnesota： APS Press， 1989：44.

[2]習平根，戚佩坤，姜子德. 鵝掌柴真菌病害鑒定[J]. 植物病理學報， 2003， 33（1）： 19-24.

[3]黃江華，葉宜麗. 鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定[J]. 廣東農業(yè)科學，2012（16）： 69.

[4]代麗婷，劉東，張艷菊.黑龍江省冬小麥雪腐病病原鑒定及生物學特性研究[J].植物保護，2013，39（1）：44-49.

[5]劉少華，陸金萍，朱瑞良，等.一種快速簡便的植物病原真菌基因組DNA提取方法[J].植物病理學報，2005，35（4）：362-365.

[6]郭鵬豪，劉秀麗，崔穎鵬，等.真菌通用引物Its1和Its4在絲狀真菌鑒定中的價值評價[J].中國微生態(tài)學雜志， 2013，25（8）：922-924.