?；撬釋?yán)重腹腔感染大鼠腸黏膜屏障功能的影響

蔡景融　武華　程鞏

[摘要] 目的 通過建立大鼠嚴(yán)重腹腔感染模型，檢測血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）的活性及D-乳酸含量，探討牛磺酸對嚴(yán)重腹腔感染大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用。 方法 實(shí)驗(yàn)于2015年5～7月將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組：對照組（C組）、腹腔感染組（I組）和治療組（T組），每組18只。C組僅輕微翻動盲腸后關(guān)腹，I、T兩組采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）。T組于術(shù)后即刻腹腔注射?；撬崛芤海?00 mg/kg），而C組、I組術(shù)后即刻腹腔注射等體積生理鹽水。各組分別于造模后6、12、24 h隨機(jī)取6只大鼠，檢測血漿DAO活性和D-乳酸含量。 結(jié)果 C組各檢測指標(biāo)在各時間點(diǎn)無明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），I組、T組各檢測指標(biāo)均隨時間延長呈增高趨勢。I組、T組各檢測指標(biāo)在各時間點(diǎn)均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T組各檢測指標(biāo)在各時間點(diǎn)均低于I組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 牛磺酸對大鼠嚴(yán)重腹腔感染時腸黏膜屏障功能有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 牛磺酸；腹腔感染；腸黏膜屏障；二胺氧化酶；D-乳酸

[中圖分類號] R605 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）07-0022-03

[Abstract] Objective To explore the possible protective effect of taurine on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection through established the model of rats with severe abdominal infection， measuring the activity of diamine oxidase（DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma. Methods From May to July 2015 fifty-four SD males rats were randomly divided into three groups， 18 rats in each group）： control group （group C）， abdominal infection group（group I） and treatment group（group T）. The rats of group C were only slightly changed the cecal several times before definitive abdominal closure. The rats in group I and group T were established by cecal ligation and puncture （CLP）. The rats in group T received intraperitoneal injection of taurine（200 mg/kg） immediately after the operation， however， the rats in group C and group I received intraperitoneal injection of equivoluminal normal saline. Six rats in each group were randomly picked up at 6， 12， 24 h after operation to have the activity of diamine oxidase （DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma measured. Results There was no significant difference at each time point of each detection index in group C（P>0.05）. In group I and group T， each detection index was rising with increased postoperative time， and they were higher than those of group C at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Compared with group I， each detection index of group T was lower at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Conclusion Taurine has a certain protective effect on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection.

[Key words] Taurine； Abdominal infection； Intestinal mucosal barrier； Diamine oxidase； D-lactic acid

腹腔感染在普通外科較為常見，多由手術(shù)、創(chuàng)傷、消化道穿孔、急性胰腺炎、腸外瘺等原因?qū)е?。?yán)重腹腔感染時，腸黏膜在各種致病因素作用下出現(xiàn)不同程度的損傷，通透性有所增加，腸道內(nèi)的細(xì)菌（多為革蘭陰性桿菌）和內(nèi)毒素從腸腔經(jīng)門靜脈、淋巴循環(huán)移位可進(jìn)一步引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、膿毒癥、甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]，病情嚴(yán)重，治療費(fèi)用昂貴。?；撬崾且环N由含硫氨基酸轉(zhuǎn)化而來的β-氨基酸，由于其分子結(jié)構(gòu)中的羧酸基被磺酸基取代，所以?；撬岵⒉粎⑴c蛋白質(zhì)的合成。急性炎癥反應(yīng)時，由于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒內(nèi)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的催化作用，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2與Cl-、Br-反應(yīng)生成次氯酸、次溴酸，而牛磺酸與兩者相互作用，減輕了次氯酸、次溴酸對正常組織的氧化損傷，并生成具有殺菌、抗炎、抑制氧化應(yīng)激的作用的牛磺酸氯胺、?；撬徜灏穂2]。本實(shí)驗(yàn)通過多時間點(diǎn)比較各組大鼠血漿DAO活性、D-乳酸含量變化，探討?；撬釋Υ笫蟾骨桓腥驹缙谀c黏膜屏障功能的保護(hù)作用，為將來臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

同系、出生日期相近、健康的雄性SD大鼠54只（重量200～230 g），購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。造模前于山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱重、編號。

1.2 主要試劑和儀器

?；撬幔? g）購于美國Sigma公司（北京索萊寶公司分裝）、二胺氧化酶（DAO）及D-乳酸試劑盒均購于美國Sigma公司（由武漢博士德生物工程公司分裝）。上海奔普電子天平（型號為BSM-180.4），德國Eppendorf臺式低溫離心機(jī)（型號為minispin），上海博訊電熱恒溫水浴鍋（型號為HHSII-1），日本紫外分光光度計(jì)（型號UA-16A）。

1.3 ?；撬崛芤旱呐渲品椒?/p>

應(yīng)用電子天平稱取牛磺酸2 g，用量筒量取100 mL生理鹽水，將稱取的?；撬崛芙庥谄渲?，配制成2%的?；撬崛芤阂詡湓炷：笫褂?，1周內(nèi)有效。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和模型建立

實(shí)驗(yàn)于2015年5～7月將54只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，即對照組（C組）、腹腔感染組（I組）和治療組（T組），每組18只。術(shù)前12 h禁食、不禁水。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）制作嚴(yán)重腹腔感染模型[3]。步驟如下：①稱重后腹腔注射10%水合氯醛（100 mg/kg）麻醉；②用醫(yī)用橡皮膠帶固定大鼠四肢后電推剃毛備皮、碘伏消毒；③于中、下腹做長度約2 cm的正中切口，沿中線逐層進(jìn)入腹腔；④輕微翻動腸管、系膜，識別盲腸并將其暴露于腹腔外；⑤用絲線結(jié)扎盲腸盲端約1.5 cm，注意確?；亟Y(jié)腸通暢；⑥使用18G注射器針頭在盲端穿刺兩對孔，擠出部分糞便；⑦還納盲腸后分兩層關(guān)腹，皮下注射預(yù)熱37℃生理鹽水（50 mL/kg）補(bǔ)液并防止休克，清醒后自由飲食。C組大鼠經(jīng)開腹后輕微翻動盲腸后關(guān)腹，不行第⑤、⑥兩步操作；I、T兩組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。T組大鼠術(shù)后腹腔注射?；撬崛芤海?00 mg/kg），C、I兩組大鼠術(shù)后腹腔注射等體積生理鹽水。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，清醒后自由飲食。

1.5 DAO、D-乳酸檢測

于造模后6、12、24 h三個時間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取6只大鼠，仍采用水合氯醛（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，用一次性采血針取腹主動脈血約5 mL于真空采血管中，離心15 min（3000 r/min），取血漿上清液2 mL于EP管中，置于-20℃冰箱中儲存待測。采血后應(yīng)用頸椎脫臼法將大鼠處死。采用分光光度法，嚴(yán)格依照試劑盒說明書，逐步檢測血漿DAO活性和D-乳酸含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察和腹腔情況

對照組（C組）：大鼠清醒后，可見其活動能力均較正常時稍有減弱，體溫、心率以及呼吸頻率正常，造模12 h后可見覓食行為；各時間點(diǎn)打開腹腔，均可見腸管能夠正常蠕動，未見腸管擴(kuò)張、粘連及明顯腹水。腹腔感染組（I組）：大鼠清醒后逐漸出現(xiàn)體溫升高、寒戰(zhàn)，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動能力明顯減弱，心率、呼吸頻率明顯增快，可見腹瀉癥狀。腹腔可見腸管明顯擴(kuò)張、積氣，回盲部粘連，腹腔有積液、積膿。盲腸表面可見膿性分泌物，盲腸盲端變黑、壞死。腹腔所見情況隨造模后時間延長而加重。治療組（T組）：大鼠清醒后逐漸出現(xiàn)體溫升高、活動能力減弱，心率及呼吸頻率加快，但程度均低于I組。腹腔可見腸管不同程度擴(kuò)張、積氣、回盲部粘連，腸管尚有蠕動，腹腔有積液，少量積膿，均較I組少。盲腸盲端變黑、壞死。

2.2血漿DAO活性的測定

C組各時間點(diǎn)DAO活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），I、T兩組DAO活性隨著時間推移呈增高走勢，且在相應(yīng)的時間點(diǎn)均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T組DAO活性在各時間點(diǎn)均低于I組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 血漿D-乳酸含量的測定

C組各時間點(diǎn)D-乳酸含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），I、T兩組D-乳酸含量隨著時間推移呈增高走勢，且在相應(yīng)的時間點(diǎn)均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T組D-乳酸含量在各時間點(diǎn)均低于I組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

腸黏膜屏障是指機(jī)體能夠防止腸腔內(nèi)的細(xì)菌和毒素通過腸黏膜淋巴、血液循環(huán)而進(jìn)入體內(nèi)其他組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能的總和[4]。研究表明，嚴(yán)重腹腔感染時，腸黏膜出現(xiàn)不同程度的病理變化，如腸黏膜出現(xiàn)水腫、炎性細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞壞死脫落等，這一系列變化導(dǎo)致致病菌及內(nèi)毒素移位，進(jìn)而引起腸源性感染、內(nèi)毒素血癥，極有可能進(jìn)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征[5]。因此腸黏膜損傷、通透性增加既是嚴(yán)重腹腔感染導(dǎo)致的結(jié)果，又是病情急劇惡化的主要原因之一。

嚴(yán)重腹腔感染時，腸黏膜會出現(xiàn)缺血再灌注損傷和炎癥反應(yīng)。從嚴(yán)重腹腔感染到SIRS、MODS的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴有不同程度血流動力學(xué)改變，腸道血流量減少，而腸黏膜固有的絨毛微血管結(jié)構(gòu)，使其對缺血、缺氧特別敏感，腸黏膜因缺血缺氧出現(xiàn)一定程度的損傷，然而恢復(fù)血液灌流后腸黏膜損傷進(jìn)一步加重，即腸道缺血再灌注損傷。有研究表明，?；撬崧劝凡粌H可以氧化含有巰基的氨基酸、蛋白質(zhì)，還能以N-Cl共價鍵的形式與細(xì)菌表面蛋白結(jié)合，進(jìn)而降低細(xì)菌毒力、抑制細(xì)菌繁殖[6]；?；撬崧劝贰⑴；撬徜灏纺軌蛞种仆淌杉?xì)胞活性，降低其消耗氧氣并誘發(fā)呼吸爆發(fā)的能力，除此之外，?；撬崧劝房杉せ罴?xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）與細(xì)胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)一些抗氧化酶的表達(dá)，如血紅素加氧酶、過氧化物氧化還原酶、硫氧還原蛋白等[7]；?；撬崧劝吠ㄟ^抑制核因子κB抑制蛋白激酶（IKK）的活性，減輕核因子κB抑制蛋白-α（IκB-α）的降解，防止因核因子κB（NF-κB）的激活所導(dǎo)致調(diào)控促炎因子（iNOS、TNF-α等）的基因序列轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)[8]，這種抑制促炎因子形成作用呈劑量依賴性[9]。

腸黏膜屏障損傷時，腸道固有細(xì)菌大量增殖，代謝發(fā)酵產(chǎn)生的D-乳酸可通過受損腸黏膜入血，由于哺乳動物體內(nèi)缺乏D-乳酸脫氫酶而代謝緩慢，故檢測血漿D-乳酸含量變化能準(zhǔn)確反映腸黏膜通透性變化[10]。95%以上的DAO儲存于是小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)，生理?xiàng)l件下血漿中含量甚微，其活性與腸黏膜上皮蛋白質(zhì)、核酸代謝有關(guān)。腸黏膜屏障損傷后釋放入血，當(dāng)外周血增加的速度超過肝臟的清除速度時可被檢測到，故檢測血漿DAO活性可間接反映腸黏膜機(jī)械屏障的完整性[11]。目前，在實(shí)驗(yàn)研究中血漿DAO檢測通常作為腸黏膜損傷的一個重要輔助標(biāo)志物，其特異性為100%，準(zhǔn)確性為95%，敏感性為94%[12-15]。

本研究結(jié)果顯示，I、T兩組大鼠大體觀察及腹腔情況明顯復(fù)雜于C組，體溫、心率、呼吸頻率均不同程度升高，腹腔均可見腹水、腸管粘連、盲腸盲端壞死等，但是T組整體程度較I組有所減輕。C組大鼠DAO活性及D-乳酸含量在各時間點(diǎn)比較并無明顯差異，I、T兩組大鼠DAO活性及D-乳酸含量隨時間延長呈增高趨勢，造模6 h后即出現(xiàn)輕微的腸黏膜損傷，通透性增加。隨著時間的延長，造模24 h后I、T兩組大鼠DAO活性及D-乳酸含量最高，說明此時I、T兩組大鼠腸黏膜損傷最重，但是相較于I組，T組大鼠DAO活性及D-乳酸含量在相應(yīng)時間點(diǎn)均低于I組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明牛磺酸對大鼠嚴(yán)重腹腔感染時腸黏膜損傷有較好的保護(hù)、修復(fù)作用，具體機(jī)制和量效關(guān)系還待進(jìn)一步研究，可為臨床應(yīng)用于腸內(nèi)營養(yǎng)等提供一定依據(jù)。

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（收稿日期：2015-11-21）