溫陽消飲法對胸腔積液大鼠腎臟AQP2及cAMP—PKA/PKC

李雷兵 張琦 徐建虎

摘要：目的觀察溫陽消飲法對胸腔積液模型大鼠腎臟水通道蛋白2表達(dá)的影響，探究該法治療水飲病的部分作用機(jī)制。方法將Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為溫陽消飲組（W），去桂消飲組（Q），模型對照組（M），空白對照組（K）。向W、Q、M組大鼠胸腔注射1%λ-角叉菜膠，制備胸腔積液（懸飲）模型。造模24 h后拍攝X線平片顯示造模均成功。于造模2h后給予W、Q組相應(yīng)藥液灌胃，每天1次，連續(xù)5天。造模后第5天處死各組大鼠，采集胸腔積液及腎臟組織，用蛋白印跡法檢測腎臟AQP2的表達(dá)，用酶聯(lián)免疫吸附法測定cAMP、PKA、PKC的表達(dá)。結(jié)果①胸腔積液量：與K組比較，各組均增加（P<0.05）；與M組比較，Q、W組減少（P<0.05），與Q組比較，W組較多（P>0.05）。②AQP2：與K組比較，M組降低（P<0.05）；與M組比較，Q、W組升高（P<0.05）；與Q組比較，W組升高（P>0.05）。③PKA：與K組比較，W、Q組增加（P<0.05）；其余各組間（P>0.05）。④PKC、cAMP：與Q組比較，W組cAMP增加（P<0.05）；其余各組間（P>0.05）。⑤腎組織超微結(jié)構(gòu)：與K組比較，M組腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛明顯減少；與M組比較，W、Q組腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛增多；與Q組比較，W組無明顯差異。結(jié)論①溫陽消飲法能有效減少胸腔積液模型大鼠胸腔積液量。②溫陽消飲法能上調(diào)胸腔積液模型大鼠腎組織AQP2的表達(dá)，這可能是該法治療胸腔積液大鼠的部分作用機(jī)制。③溫陽消飲法對模型大鼠腎組織的異常變化具有良性、促進(jìn)恢復(fù)的作用。④溫陽消飲法對cAMP、PKA、PKC的影響尚不明確。

關(guān)鍵詞：溫陽消飲法；胸腔積液；大鼠；腎臟；水通道蛋白2

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2016）07-0078-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Wenyang Xiaoyin method on AQP2 expression of kidney in pleural effusion rats and to explore part of its mechanism of drinking water disease. Methods： Wistar rats were randomly divided into Wenyang Huaxiaoyin group （W）， Qigui Huaxiaoyin group （Q）， model group （M） and blank control group （K）. The rats chests of W， Q and M groups were injected with 1% λ-carrageenan to make pleural effusion （Xuanyinning） model. After modeling for 24 hours， X-ray films were taken to display successful modeling. After modeling for 2 hours， W and Q were given corresponding liquid gavage， once daily for 5 consecutive days. After modeling for 5 days， the rats in each group were sacrificed to collect their pleural effusion and renal tissue. The expression of kidney AQP2 was detected by Western blotting and the expression of cAMP， PKA and PKC was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results： ① pleural effusion： Compared with K， each group increased （P<0.05）； compared with M， Q and W reduced （P<0.05）； compared with Q， W was more （P>0.05）. ②AQP2： Compared with K， M reduced （P<0.05）； compared with M， Q and W increased （P<0.05）； compared with Q， W increased （P>0.05）. ③PKA： Compared with K， W and Q increased （P<0.05）， other groups （P>0.05）. ④PKC， cAMP： Compared with Q， cAMP of W increased （P<0.05）； other groups （P>0.05）. ⑤ renal ultrastructure： Compared with K， renal tubular epithelial cell surface microvilli of M obviously decreased； compared with M， renal tubular epithelial cell surface microvilli of W and Q increased； compared with Q， W was no significant differences. Conclusion： ① Wenyang Huaxiaoyin method can effectively reduce the amount of pleural effusion of pleural effusion model rats. ② Wenyang Huaxiaoyin method can increase the expression of AQP2 in renal tissue of pleural effusion model rats， which may be part of the mechanism of the method. ③ Wenyang Huaxiaoyin method has benign and restoring function for abnormal changes of renal tissue model rats. ④ The effect of Wenyang Huaxiaoyin method is not yet clear for cAMP， PKA and PKC.

【Key words】Wenyang Huaxiaoyin method， pleural effusion， rats， kidney， aquaporin 2

水飲是中醫(yī)對病因、病理產(chǎn)物的一種獨(dú)特認(rèn)識，是人體津液代謝失常，導(dǎo)致水液不能正常運(yùn)化，停積于人體局部所形成的一種病理產(chǎn)物。文獻(xiàn)研究與臨床實(shí)踐已經(jīng)證實(shí)，胸腔積液是懸飲的代表性疾病。人體水液的代謝與肺脾腎三焦關(guān)系密切，水飲的形成與肺氣宣降、脾陽溫運(yùn)、腎陽溫化、三焦通達(dá)等功能的失常密切相關(guān)，“腎者，水臟，主津液”（《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》），腎是人體水液運(yùn)行、敷布、排泄的重要臟器，腎的氣化功能不僅是人體水液代謝的動(dòng)力之一，肺宣發(fā)肅降津液、脾轉(zhuǎn)化運(yùn)輸津液的動(dòng)力之根，同時(shí)維持著機(jī)體水液代謝的平衡。

“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”為水飲病治本大法，此法被后世醫(yī)家奉為治療水飲病的圭臬。仲景所創(chuàng)的苓桂術(shù)甘湯為“溫藥和之”的代表方，具有溫陽健脾、利水蠲飲之功，側(cè)重于溫陽治本；葶藶大棗瀉肺湯瀉肺行水，側(cè)重于消飲治標(biāo)。AQPs是一組細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在水液的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用，對機(jī)體各臟腑組織水液吸收、液體分泌以及各細(xì)胞、組織、器官、全身的水液代謝平衡起著重要作用。本研究選擇苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯作為溫陽消飲法的代表方，并以上方去桂枝作為對比，試圖觀察溫陽消飲法代表方、去桂消飲方對胸腔積液大鼠腎臟水通道蛋白2表達(dá)影響有無差異，以探討該法消除水飲的部分作用機(jī)制，并觀察以桂枝為代表的溫陽藥在此法中的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物成都達(dá)碩生物科技有限公司提供SPF級成年Wistar大鼠40只（雌雄各半），平均體重180～230 g。

1.1.2藥物與主要試劑苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯所有生藥購自成都市國際商貿(mào)城荷花池中藥材專業(yè)市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為正品。λ-角叉菜膠粉劑（Sigma 公司，產(chǎn)品批號：0009064577）及戊巴比妥鈉（Sigma 公司，產(chǎn)品批號：69020100）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組方法，將其分為4組即W組（溫陽消飲組，10只），Q組（去桂消飲組，10只），M組（模型對照組，10只），K組（空白對照組，10只）。每組雌雄各半，并予以標(biāo)號。

1.2.2動(dòng)物模型建立與評價(jià)對M、W、Q組大鼠參照文獻(xiàn)[1]，以1.5%戊巴比妥鈉（0.25 mL/100 g大鼠體重）腹腔注射麻醉，將進(jìn)入麻醉狀態(tài)的大鼠依據(jù)體重，向右側(cè)胸膜腔（第3或第4肋間隙）一次性注入1%λ-角叉菜膠溶液（雌性0.8 mL/只，雄性1.0 mL/只），制成滲出性胸膜炎大鼠模型。

動(dòng)物于造模24h后進(jìn)行模型評價(jià)。予以1.5%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)高頻全自動(dòng)動(dòng)物X-光機(jī)拍片，在CR數(shù)字成像系統(tǒng)下對右側(cè)胸腔病變情況進(jìn)行觀察，3組大鼠均造模成功（見圖1、圖2）。

如圖1、圖2，X平片所示：大鼠右側(cè)肋膈角變鈍，肺野呈均勻致密陰影，肋間隙變寬，縱膈向健側(cè)移位。故可以判斷為大鼠右側(cè)胸腔積液。

1.2.3中藥煎劑的制備及給藥方法根據(jù)仲景《金匱要略》記載的苓桂術(shù)甘湯和葶藶大棗瀉肺湯的藥物組成比例，即：茯苓：桂枝：白術(shù)：生甘草為4∶ 3∶ 3∶ 2，葶藶子：大棗為6∶5。按照《藥典》有關(guān)制劑要求，采用合煎形式，制成苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯（溫陽消飲代表方）藥液、苓桂術(shù)甘湯合葶藶大棗瀉肺湯去桂枝（去桂消飲方）的藥液（2 g生藥/mL）。于造模2 h后，W組給予溫陽消飲代表方藥液灌胃給藥，去桂消飲組給予去桂消飲方藥液灌胃給藥，藥物劑量按照成人日用量與大鼠體表面積折算為等效劑量（5 mL/kg）[2]，每日灌胃給藥1次，連續(xù)5 d。K、M組常規(guī)飼養(yǎng)，未施加任何處理措施。

1.2.4標(biāo)本采集分別于造模后第5天處死各小組動(dòng)物。以1 mL一次性注射器抽取胸腔積液，剪取雙側(cè)腎臟，分別固定于4%多聚甲醛固定液中，以備進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腎臟AQP2表達(dá)情況比較 結(jié)果見表1及圖3。

由表1可知，與空白對照組比較，模型對照組表達(dá)降低（P<0.05）；與模型對照組比較，溫陽消飲組、去桂消飲組表達(dá)均升高（P<0.05）；與去桂消飲組比較，溫陽消飲組表達(dá)雖有升高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2腎臟cAMP、PKA、PKC的含量，胸腔積液量比較結(jié)果見表2。

由表2可知，胸腔積液量：與空白對照組比較，各組胸腔積液量均增加（P<0.05）；與模型對照組比較，去桂消飲組、溫陽消飲組胸腔積液量減少（P<0.05），與去桂消飲組比較，溫陽消飲組胸腔積液量較多，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腎臟PKA含量：與空白對照組比較，溫陽消飲組、去桂消飲組PKA含量增加（P<0.05）；其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。腎臟PKC、cAMP含量：與去桂消飲組比較，溫陽消飲組cAMP增加（P<0.05）；其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3腎臟組織超微結(jié)構(gòu)與空白對照組（圖4）比較，模型對照組（圖5）腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛（a）明顯減少；與模型對照組比較，溫陽消飲組（圖6）、去桂消飲組（圖7）腎小管上皮細(xì)胞表面微絨毛增多；與去桂消飲組比較，溫陽消飲組無明顯差異。

3討論

津液代謝與人體各臟腑生理機(jī)能的正常都密切相關(guān)，其中以肺、脾、腎及三焦的功能正常尤為重要，它們共同參與完成人體津液的正常生成、輸布、排泄的復(fù)雜過程?！端貑枴つ嬲{(diào)論》曰：“腎者水臟，主津液”、“腎為水之下源”等論述說明腎臟在人體水液輸布、排泄過程中發(fā)揮著重要作用。津液代謝失常、水飲停聚為患的痰飲類疾病與肺、脾、腎及三焦的生理機(jī)能失常密切相關(guān)。痰飲學(xué)說源于《內(nèi)經(jīng)》、始見于《金匱要略》，痰飲是人體水液代謝失常所形成的一種病理產(chǎn)物，同時(shí)也是一種新的致病因素（繼發(fā)性病因），作用于人體導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，繼發(fā)各種復(fù)雜的病理變化。痰飲為陰邪，其形成與人體陽氣的失宣、不運(yùn)、不化有關(guān)，其形成后最易損傷人體陽氣，妨礙陽氣的溫煦、推動(dòng)、氣化。因此對于痰飲類疾病要重視陽氣的恢復(fù)，臨床常常借助于溫藥以振奮陽氣，使其溫運(yùn)、蒸騰氣化功能復(fù)常，從而消除水飲病邪?！督饏T要略》提出“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”的痰飲病的治療大法，此法受到歷代醫(yī)家的推崇。苓桂術(shù)甘湯和葶藶大棗瀉肺湯對痰飲類的疾病均有治療作用，臨床當(dāng)中常將兩方合用，用于對多種病因?qū)е碌男厍环e液類疾病的治療。如在羥基喜樹堿配合中藥治療惡性胸腔積液的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)：羥基喜樹堿胸腔化療配合中藥苓桂術(shù)甘湯和葶藶大棗瀉肺湯加減治療惡性胸水，近期效果明顯，毒副反應(yīng)小，安全可靠，能夠明顯延長胸水復(fù)發(fā)的時(shí)間，降低了治療成本[3]。

AQP2位于集合管主細(xì)胞管腔和靠近管腔側(cè)的囊泡內(nèi)，是腎臟分布最多的一種AQPs，也是對抗利尿激素敏感的水通道蛋白。當(dāng)精氨酸加壓素水平增高后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的囊泡與管腔細(xì)胞膜融合，AQP2通過出胞運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移至管腔細(xì)胞膜上，使管腔側(cè)細(xì)胞膜上AQP2數(shù)量增加，對水的通透性增高[4]。本課題組在先期實(shí)驗(yàn)當(dāng)中已發(fā)現(xiàn)溫陽消飲法可上調(diào)胸腔積液大鼠腎臟AQP2表達(dá)[5]，本實(shí)驗(yàn)通過去除桂枝，旨在探討以桂枝為代表的溫陽藥物在本法當(dāng)中的作用及對AQP2的影響差別。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，溫陽消飲法能夠明顯減少胸腔積液模型大鼠的胸腔積液量。與Q組比較，W組胸腔積液量較多，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未造成陽虛模型，雖與懸飲病相似，而無陽虛證有關(guān)，桂枝在溫陽消飲方中作用尚不明確。溫陽消飲法上調(diào)模型大鼠腎臟組織AQP2的表達(dá)，從而增加腎臟對水液的重吸收作用。該研究結(jié)果與既往的研究結(jié)果一致[5]。當(dāng)水飲停聚胸脅時(shí)，腎主水的功能受到影響，所以M組的APQ2表達(dá)明顯下降，當(dāng)予以溫陽消飲法治療后，通過其健脾蠲飲、溫陽行氣的作用，增強(qiáng)懸飲模型動(dòng)物的腎臟AQP2的表達(dá)使之恢復(fù)或接近正常水平。W組與Q組比較雖有增強(qiáng)但不明顯，說明桂枝在此模型中對腎臟組織AQP2的影響作用并不十分明顯，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。對cAMP-PKA/PKC信號通路的影響作用機(jī)制尚不明確，cAMP-PKA/PKC信號通路對AQP2的影響亦不確定，對此有待進(jìn)一步研究。微絨毛的功能是通過增大細(xì)胞表面，擴(kuò)大吸收面積，參與細(xì)胞的吸收功能。與K組比較，M組微絨毛明顯減少，說明λ-角叉菜膠胸腔注射不僅引起胸腔的炎性變化，還對腎臟組織有影響，使腎主水的功能失常，同時(shí)從側(cè)面證明人體是一個(gè)有機(jī)整體，某處的病變對全身臟腑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)都有影響。溫陽消飲法能夠明顯增多微絨毛，使腎臟對水液的重吸收增強(qiáng)，發(fā)揮其主水的作用。

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