中國西門塔爾太行類群牛肉質(zhì)性狀與SLC27A1基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析

張喜忠　王曦　張?jiān)獞c　楊效民　王棟才　靳光　李博　徐芳　程景

摘要：為探索SLC27A1基因?qū)εＨ赓|(zhì)性狀的影響，選取中國西門塔爾牛太行類群牛公牛、閹牛各20頭為研究對象，采用PCR法分析SLC27A1的基因遺傳多態(tài)性。檢測到SNP位點(diǎn)為S5650：T>C，該位點(diǎn)存在有3種基因型，其中CC基因型頻率較高（62.5%），TT基因型頻率最低（12.5%）。采用GLM對內(nèi)質(zhì)相關(guān)性狀與SLC27A1基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，剪切力、肉色a、肉色b表型中，CC與TT及CT與丌差異均極顯著（P<0.01），其他性狀間差異不顯著（P>0.05），閹牛與公牛間對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著（P<0.05）。采用Real-time PCR分析，CC基因型在肌肉與脂肪中的表達(dá)量比基因型CT與TT差異顯著（P<0.05），閹牛與公牛之間的表達(dá)量在肌肉中差異極顯著（P<0.01）。SLC27A1基因S5650：T>C位點(diǎn)突變對中國西門塔爾牛太行類群肉質(zhì)性狀存在一定的遺傳效應(yīng)，

關(guān)鍵詞：SLC27A1基因；肉質(zhì)性狀；SNP；中國西門塔爾太行類群

SLC27A1（S0lute carrier family 27 member 1），又稱作FATP（Fatty acid transpon pmteins），是脂肪酸運(yùn)輸?shù)鞍准易宄蓡T，具有調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸在機(jī)體局部和全身系統(tǒng)中新陳代謝的作用。提純的SLC27A1具有類似乙酰輔酶A的活性，并通過催化機(jī)體內(nèi)雙層分子膜中的脂肪酸不斷轉(zhuǎn)化成脂肪酸乙酰輔酶A來加快脂肪酸的吸收。通過組織中SLC27A1的活化作用，可以促使胰島素調(diào)控長鏈脂肪酸的攝入，且SLC27A1具有分配脂肪酸到機(jī)體各組織中的作用。SLC27A1基因敲除小鼠脂肪組織中的脂滴半徑小于正常小鼠，且在低溫環(huán)境下維持體溫恒定的能力很差，這說明SLC27A1在運(yùn)送長鏈脂肪酸通過質(zhì)膜維持能量平衡、產(chǎn)生熱量等生理過程中起著至關(guān)重要的作用，是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子。SLC27A1基因失活的小鼠可免受食源性肥胖的困擾。

Ordovas等為獲得牛的SLC27A1的DNA片段，利用人類該基因的mRNA序列擴(kuò)增了一段505bp牛的該基因片段并掃描了牛的BAC文庫，得到了包含SLC27A1的BAC克隆，并將SLC27A1基因定位于染色體7q11-q12上，該基因有12個外顯子，編碼646個氨基酸，近年來已在7號染色體上發(fā)現(xiàn)了一些與脂肪代謝相關(guān)聯(lián)的性狀位點(diǎn)（QTL）。

本研究利用PCR測序技術(shù)針對西門塔爾太行類群雜交牛的SLC27A1基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用測序技術(shù)進(jìn)行基因型檢測，將不同基因型與脂肪相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期找到與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，以期為標(biāo)記輔助選擇在提高肉質(zhì)性能上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動物與屠宰檢測 迅速取剛屠宰后的中國西門塔爾太行類群牛公牛、閹牛各20頭，每頭牛血3 mL，2mLACD抗凝，保溫箱中帶回，用于提取基因組DNA。取眼肌部位10 cm3肉送檢。取眼肌肉與皮下脂肪各0.5 g，放入液氮冷凍后置于-80℃保存。

1.1.2引物 SLC27A1基因比較保守，不同物種間編碼區(qū)差異較小，所以使用小鼠同源序列設(shè)計(jì)SLC27A1引物，其擴(kuò)增片段信息及B-actin基因引物如表1所示，B-actin基因引物根據(jù)文獻(xiàn)獲得。

1.2SLC27A1基因型檢測

1.2.1PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：在100uLEP管中加入10×PCR緩沖液2.0uL、2.5 mmol/L dNTP1.6uL、Tag DNA聚合酶1 U/uL、上下游引物各30ng、基因組DNA約100 ng、加去離子水至總反應(yīng)體積20uL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸90 s），72℃延伸10 min，4℃保存。取2uLPCR產(chǎn)物與0，5uL溴酚藍(lán)緩沖液混勻，0.8%瓊脂糖凝膠，110 v電泳0.5 h后，紫外燈下觀察有無擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2PCR產(chǎn)物的回收測序 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收得到的PCR產(chǎn)物與pMDl9T-vector連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，搖菌，菌液送北京奧科生物有限公司進(jìn)行測序，檢測樣品的SNP基因型。

1.3定量的方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.3.1牛皮下脂肪RNA的提取 按照QIAGEN脂肪RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行，采用Trizol一步法提取牛皮下脂肪與肌肉中總RNA。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及定量PCR 將制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1010至1038個稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，同時設(shè)陰性對照。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 7.5uL，上游引物0.3uL，下游引物0.3uL，組織cDNA或B-actin質(zhì)粒模板1.0uL，加無菌水至15uL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)：55℃30 s：每30 s提高0.5℃至95℃，共81個循環(huán)。為了保證每個組織目的基因相對表達(dá)的可重復(fù)性，消除因加樣造成的誤差，每個樣品的檢測設(shè)3個重復(fù)。Real-time PCR的產(chǎn)物特異性通過凝膠電泳結(jié)合溶解曲線分析加以驗(yàn)證。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1SLC27A1基因多態(tài)性分析 根據(jù)測序結(jié)果，得出SLC27A1基因不同基因型，然后計(jì)算基因頻率與基因型頻率。

3.討論

3.1SLC27A1基因多態(tài)性及群體遺傳特性分析

本研究以牛的SLC27A1基因作為影響肉牛肉質(zhì)性狀的候選基因，借助PCR測序技術(shù)對部分SLC27A1基因進(jìn)行了檢測，檢測得到1個SNP位點(diǎn)S5650：T>C，可能由于樣品少的原因，TT型頻率較低，不能反映整個牛群的遺傳結(jié)構(gòu)，但也可能因?yàn)橹袊鏖T塔爾太行類群牛在品種形成過程中，親本祖先地域與親緣關(guān)系上較遠(yuǎn)，經(jīng)過3～4代的結(jié)合，還沒有實(shí)現(xiàn)遺傳上的哈一溫平衡，造成基因頻率與基因型頻率的特異性。

3.2SLC27A1基因與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

閹與否對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著，也能說明，閹牛對肉質(zhì)性狀的影響，閹牛的肉質(zhì)更具有彈性與可咀嚼性?；蛐团c表型差異不顯著，可能是反映真實(shí)的一種情況，但也有可能是由于樣本量少，樣品的檢測結(jié)果存在較大的方差，使得統(tǒng)計(jì)差異不顯著?；蛐团c表達(dá)量的方差分析表明，CC型表達(dá)差異顯著，可能CC基因型影響SLC27A1基因在肌肉與脂肪中的表達(dá)，表達(dá)量的變化可能會影響脂肪在肌肉組織與脂肪組織中的沉積。wsng等發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因表達(dá)部位與年齡存在一定關(guān)系，說明SLC27A1基因在不同時期在不同雞組織部位影響脂肪的代謝，但是在肉質(zhì)檢測的表型統(tǒng)計(jì)中差異不顯著，這可能與采樣及樣本的數(shù)量有一定關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。

因?yàn)镾LC27A1基因與脂肪的作用有關(guān)，Ordovds等于2005將SLC27A1基因定位于牛的第7號染色體上，2008年在荷斯坦與西班牙兩個牛品種Asturiana de los Valles和MenorUuina中發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因不會影響乳脂含量。呂延飛等對SLC27A1基因SNPs與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，首次在3UTR發(fā)現(xiàn)了G64A位點(diǎn)，exon3的T112c位點(diǎn)的c等位基因?qū)Ξa(chǎn)奶量起到正效應(yīng)，通過提高cc基因型頻率有望提高中國荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量。由此推斷，SLC27A1基因可作為影響中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量的候選基因，進(jìn)行更深入的研究。Lv等、Ordovas等將SLC27A1作為候選基因，在中國荷斯坦奶牛中研究發(fā)現(xiàn)兩個SNP位點(diǎn)，其中等位基因C與奶牛的產(chǎn)奶性狀有關(guān)，CC基因型產(chǎn)奶量差異顯著。zhang等在安格斯與和牛雜交一代中研究30個復(fù)合表型，發(fā)現(xiàn)SLC27A1基因影響肉中油酸Oleic acid含量（P=0.0155），從而影響肉的風(fēng)味與肉質(zhì)。

針對SLC27A1基因在中國西門塔爾牛太行類群的群體分析，檢測到一個SNP位點(diǎn)S5650：T>C，同時檢測到基因型為CC、CT與TT。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，剪切力表型中CC與TT差異極顯著（P>0.01），肉色a、肉色b表型中，CC與TT、CT與TT差異均極顯著（P<0.01）。閹與否對肉質(zhì)的彈性與咀嚼性差異顯著（P<0.05），與肉樣品的pH、硬度1、硬度2、內(nèi)聚性、膠粘性等表型值的相關(guān)分析，結(jié)果表明差異不顯著（P<0.05），需擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究。從總的表型與基因型分析看，CC型對應(yīng)的肉質(zhì)性狀表現(xiàn)為肉色值低、剪切力高、熟肉率高、彈性強(qiáng)等特點(diǎn)。

3.3熒光定量

由于SLC27A1基因功能的特殊性，不同組織和器官中其表達(dá)量不同，在一些快速代謝脂肪酸的組織器官，如心臟、肌肉、脂肪組織中表達(dá)量最高。轉(zhuǎn)基因鼠心臟過度表達(dá)SLC27A1會引起心肌炎。而SLC27A1基因的表達(dá)量中，不同基因型之間在肌肉與脂肪中的表達(dá)量差異顯著（P<0.05）。該基因在閹牛肌肉中的表達(dá)量存在極顯著差異，可能會影響到牛肉的肉質(zhì)性狀。是否可以用于分子選育，還需進(jìn)一步的研究，

4.小結(jié)

本研究采用基因SNP位點(diǎn)檢測方法，對40頭牛個體的SLC27A1基因部分區(qū)段進(jìn)行遺傳變異檢測，采用GLM模型分析SLC27A1基因S5650：T>C位點(diǎn)突變對中國西門塔爾牛太行類群的部分屠宰與肉質(zhì)性狀的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在群體間表現(xiàn)出較大的差異性，SLC27A1基因S5650：T>C位點(diǎn)突變對中國西門塔爾牛太行類群部分肉質(zhì)性狀有較大的遺傳效應(yīng)，可進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，用于肉牛品種培育過程中標(biāo)記輔助選擇，也可作為改善牛肉質(zhì)量的重要候選基因，但有關(guān)該位點(diǎn)遺傳效應(yīng)差異、影響的分子機(jī)制及突變對動物體脂肪合成的生理生化作用方面值得進(jìn)一步深入研究。