雙波長(zhǎng)雙指示劑催化光度法測(cè)定牛奶中的痕量鐵

王偉華　張坤

摘要：以酸性介質(zhì)中痕量鐵（III）催化的雙氧水氧化中性紅和亞甲基藍(lán)褪色原理為基礎(chǔ)，建立了雙波長(zhǎng)雙指示劑催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定痕量鐵的新方法。確定的最佳試驗(yàn)條件為HCI用量為0.5 mL，亞甲基藍(lán)用量為3 mL，中性紅用量為0.4 mL，3%的雙氧水用量為0.5 mL，反應(yīng)時(shí)間為8 min，反應(yīng)溫度為100℃，線性范圍為0.4～20.0ug/L，回收率在85%-89%之間，將該方法與經(jīng)典原子吸收光度法相比，具有反應(yīng)時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、精確度好的優(yōu)點(diǎn)，適合牛奶中痕量鐵的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：痕量鐵；雙波長(zhǎng)；雙指示劑；催化光度法；牛奶

人體內(nèi)65%的鐵存在于血液中，70%～75%的鐵以血紅素蛋白質(zhì)的形式存在，主要有血紅蛋白、肌紅蛋白及部分酶。25%～30%的鐵為非血紅素鐵，有鐵蛋白、血鐵黃素及部分酶。鐵蛋白和血鐵黃素是儲(chǔ)存鐵的基本形式，主要存在于肝臟、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓中。前者為水溶性，適應(yīng)于短期快速儲(chǔ)存的需要，后者為脂溶性，可適應(yīng)于較長(zhǎng)期限的鐵儲(chǔ)存。在缺鐵性貧血發(fā)生前，儲(chǔ)存鐵就幾乎全部耗竭。鐵的主要生理功能是通過血紅蛋白運(yùn)輸氧和二氧化碳，還通過肌紅蛋白起固定和儲(chǔ)存氧的作用。當(dāng)人缺鐵時(shí)，不僅血紅蛋白、肌紅蛋白等的合成受阻，而且使氧的運(yùn)輸與儲(chǔ)存、二氧化碳的運(yùn)輸與釋放、電子傳遞、氧化還原反應(yīng)等代謝過程發(fā)生紊亂，出現(xiàn)各種癥狀。當(dāng)日糧中鐵含量長(zhǎng)期低于10 mg/kg時(shí)，就會(huì)引起血紅蛋白含量降低，紅細(xì)胞減少，造成缺鐵性貧血。鐵等微量元素在奶牛的生理生化過程中起非常重要的作用，直接影響到奶牛的健康狀況，作為牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)元素，鐵也影響到牛奶的品質(zhì)。測(cè)定鐵的方法很多，早期以比色法和分光光度法為主，20世紀(jì)50年代后發(fā)展了原子吸收分光光度法（成本高）、溶出伏安法（費(fèi)時(shí)）、高效液相色譜法（成本高）、x光-螢光分析法（靈敏度差）等技術(shù)。

動(dòng)力學(xué)分析法是利用反應(yīng)速度和反應(yīng)物濃度、催化劑之間的關(guān)系而進(jìn)行定量分析的方法，與傳統(tǒng)的熱力學(xué)方法不同，它一般利用較慢的化學(xué)反應(yīng)作指示反應(yīng)，它的測(cè)量在體系達(dá)到平衡狀態(tài)之前進(jìn)行，擴(kuò)大了可利用的化學(xué)反應(yīng)范圍。動(dòng)力學(xué)分析法最初用于生物化學(xué)、放射化學(xué)和氣相擴(kuò)散等研究，已有70多年的歷史，早期發(fā)展較慢。直到上世紀(jì)60年代才引起了分析化學(xué)界的重視，開展了大量動(dòng)力學(xué)分析法的研究。近年來分析儀器日趨自動(dòng)化，其應(yīng)用于分析化學(xué)的各分支學(xué)科也愈來愈廣泛，研究者闡述了動(dòng)力學(xué)在分析化學(xué)中的應(yīng)用及發(fā)展。在催化動(dòng)力學(xué)分析法中，常用的檢測(cè)手段有光度法、熒光法、電化學(xué)分析法、電位法等。其中光度法因操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好成為催化法中應(yīng)用廣泛的方法。與傳統(tǒng)的熱力學(xué)平衡法相比，動(dòng)力學(xué)方法具有反應(yīng)選擇性好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

本研究在鹽酸介質(zhì)中，利用鐵催化過氧化氫氧化亞甲基藍(lán)和中性紅褪色的指示反應(yīng)，通過測(cè)定520 nm和660 nm下吸光度的變化及其與鐵濃度的線性關(guān)系，建立了雙波長(zhǎng)測(cè)定痕量鐵的新方法。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、不用分離可直接測(cè)定牛奶中的痕量鐵。本研究旨在建立準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，為對(duì)痕量鐵的檢測(cè)和監(jiān)控提供參考。

1.材料與方法

1.1材料與試劑

牛奶材料為新農(nóng)牌牛奶（百利包），市售。中性紅、亞甲基藍(lán)、硫酸鐵、硝酸、鹽酸、過氧化氫、硫脲等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)設(shè)備

通風(fēng)櫥，湖南奧立龍現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司：箱式電阻爐，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；萬用電子爐，上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司：TSA-990型原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司：TM-1900型雙束光紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司：HG214-FC104型電子分析天平，北京百萬電子科技中心。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1吸光度測(cè)定 在兩支25 mL比色管中加入0.5 mL HCl、3 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.4 mL中性紅溶液、0.5 mL雙氧水，其中1支加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另1支不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為An），用水稀釋至刻度，搖勻。置于沸水浴中，加熱8 min，迅速取出，用自來水沖淋冷卻，使反應(yīng)停止。以蒸餾水作參比，在520 nm和660 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定非催化和催化體系的吸光度A520n、A660n、A520、A660，并計(jì)算吸光度差值，△A520=A520n-A520，△A660=A660n-A660，△A=△A520+△A660。

1.3.2鹽酸用量的選擇 取10支試管分成2組，每組5支，分別加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的鹽酸溶液，再加入3 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.4 mL中性紅溶液、0.5 mL雙氧水，其中一組加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另一組不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為Ao），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。測(cè)吸光度。

1.3.3亞甲基藍(lán)用量的選擇 取12支試管分成2組，每組6支，兩組分別加入1、2、3、4、5、6 mL的亞甲基藍(lán)溶液，再加入0.5 mL HCl、0.4 mL中性紅溶液、0.5 mL雙氧水，其中一組加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另一組不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為Ao），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。測(cè)吸光度。

1.3.4中性紅用量的選擇 取14支試管，分成2組，每組7支，兩組分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的中性紅溶液，再加入0.5 mL HCl、3 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.5 mL雙氧水，其中一組加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另一組不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為An），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。測(cè)吸光度。

1.3.5雙氧水的用量選擇 取10支試管，分成2組，每組5支，兩組分別加入0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的體積分?jǐn)?shù)3%的雙氧水，再加入0.5 mLHCl、3 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.4 mL中性紅溶液，其中一組加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另一組不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為An），用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。測(cè)吸光度。

1.3.6時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響 取10支試管，分成2組，每組5支，一組加入0.5 mL HCl、3 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.4 mL中性紅溶液、0.50 mL雙氧水，其中1支加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另1支不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為An），用水稀釋至刻度，搖勻。置于沸水浴中，每組分別加熱3、4、5、6、7、8 min后，迅速取出，用自來水沖淋冷卻，使反應(yīng)停止。測(cè)吸光度。

1.3.7溫度對(duì)反應(yīng)體系的影響 取12支試管，分成2組，每組6支試管，兩組的加熱溫度分別為50、60、70、80、90、100℃，再加入0.5 mL HCl、3.0 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.4 mL中性紅溶液，其中一組加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另一組不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為A。），用水稀釋至刻度，搖勻。加熱8 min，迅速取出，用自來水沖淋冷卻，使反應(yīng)停止。測(cè)吸光度。

1.3.8鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 取10支試管，分成5組，2支一組，分別加入0.5 mL HCl、3.00 mL亞甲基藍(lán)溶液、0.40 mL中性紅溶液、0.50 mL雙氧水，每組中其中1支加入鐵（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（催化反應(yīng)，吸光度為A），另1支不加鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（非催化反應(yīng)，吸光度為An），用水稀釋至刻度，搖勻。鐵標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為0、0.006、0.009、0.012、0.015ug/mL，置于沸水浴中，加熱8 min（秒表計(jì)時(shí)）后，迅速取出，用自來水沖淋冷卻，使反應(yīng)停止。測(cè)吸光度。

1.3.9樣品的制備 取干凈瓷坩堝置高溫爐中，在500～550℃下灼燒0.5 h，移至爐口冷卻至200℃以下取出，放在干燥器中冷卻至室溫，精密稱量，并重復(fù)灼燒至恒重。

加入5～10 g牛奶樣品后，精密稱量。把盛有牛奶的坩堝置于電爐上，小心加熱使樣品充分碳化至無黑煙產(chǎn)生，然后置高溫爐中，在500～550℃灼燒至無碳粒，灰化完全。冷卻至200℃以下后取出放入干燥器中冷卻至室溫，稱量。重復(fù)灼燒至前后兩次稱量相差不超過0.5 mg為恒重。

1.3.10牛奶樣品中鐵含量的測(cè)定 200 mL牛奶得灰分1.29 g。用稀鹽酸溶解，定容在100 mL容量瓶中，取兩支試管，1支加入樣品溶液，另1支不加。測(cè)吸光度。

1.3.11重現(xiàn)性的測(cè)定 將試驗(yàn)中的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液換成樣品，同時(shí)做空白溶液對(duì)比，測(cè)定其吸光度，求△A。分別作6組，比較每次的試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.12穩(wěn)定性的測(cè)定 將鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液換成樣品提取液，同時(shí)做空白溶液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算出△A。每隔4h測(cè)1次，觀察結(jié)果變化情況。

1.3.13回收率測(cè)定 取6支比色管，分成3組，每組2支試管。每組的2支試管，第一組1支加上樣品提取液，再加上5ug/L鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，另1支不加，作空白對(duì)照，第二組1支試管加上樣品提取液，再加上10ug/L的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，另1支不加，作空白對(duì)照，第三組1支試管加上樣品提取液，再加上20ug/L的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，另1支不加，作空白對(duì)照。分別測(cè)定吸光度，計(jì)算△A。

1.3.14原子吸收法Fe標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 吸取鐵的濃度為0、0.5、1.0、2.0、3.0ug/mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于100mL容量瓶中，以0.5 mol/L的硝酸稀釋至刻度，混勻，將處理好的樣品溶液、試劑空白液和鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液分別導(dǎo)人火焰原子化器進(jìn)行測(cè)定，記錄其對(duì)應(yīng)的測(cè)量值。

1.3.15原子吸收法測(cè)定樣品中鐵的含量 稱取0.675 2 g灰分用稀硝酸溶解，100 mL容量瓶中定容，按儀器說明書的操作步驟進(jìn)樣測(cè)定。

2.結(jié)果與分析

2.1吸收曲線的確定

按照“1.3.1”的方法，分別配置催化和非催化體系溶液，以水為參比，在400～800 nm范圍內(nèi)分別測(cè)定吸光度A，繪制吸收曲線（圖1）。在催化和非催化體系中均有兩個(gè)吸收峰，其最大吸收波長(zhǎng)在520 nm和660 nm處，它們分別對(duì)應(yīng)于中性紅和亞甲基藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)，且在520nm和660 nm處△A最大。故分別選用520 nm和660 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2反應(yīng)介質(zhì)及用量的確定

按“1.3.2”的方法，考察HCl、H2SO4、HNO3等不同介質(zhì)對(duì)反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明，以HCl為介質(zhì)靈敏度最高，并且當(dāng)0.01 mol/LHCl用量為0.5 mL時(shí)，有較大而穩(wěn)定的△A。故選用0.5 mL0.01 moI/LHCl為反應(yīng)介質(zhì)（圖2）。

2.3亞甲基藍(lán)和中性紅溶液用量的確定試驗(yàn)

按照“1.3.3”和“1.3.4”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果（圖3、圖4）表明，隨著亞甲基藍(lán)和中性紅溶液用量的增大，△A都呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)亞甲基藍(lán)和中性紅溶液的用量分別為3 mL和0.4 mL時(shí)，△A最大。所以本試驗(yàn)選取亞甲基藍(lán)和中性紅溶液的量分別為3mL和0.4mL。

2.4雙氧水用量的確定

按照“1.3.5”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著雙氧水用量的增大，△A先增大后減小，發(fā)現(xiàn)0.5 mL3%的雙氧水對(duì)Fe³⁺的催化最明顯，△A最大，所以本試驗(yàn)選用0.5 mL 3%的雙氧水（圖5）。

2.5時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響

按照“1.3.6”的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間從3 min開始△A逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)到8 min時(shí)△A出現(xiàn)最大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間再增加△A基本不變。因此本試驗(yàn)選8 min為反應(yīng)時(shí)間（圖6）。

2.6溫度對(duì)反應(yīng)體系的影響

按照“1.3.7”的方法，測(cè)定不同溫度下的△A（圖7）。結(jié)果表明，反應(yīng)速度隨著溫度的增加明顯加快，當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，反應(yīng)速度基本不再變化。

2.7鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

改變鐵（III）的濃度，按照“1.3.8”的方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，鐵（III）的質(zhì)量濃度在0.4～20ug/L的范圍內(nèi)與△A呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為△A=57.523 OP-0.006 2（r=0.994 4，極顯著）。

2.8樣品分析

2.8.1共存離子的影響 在試驗(yàn)條件下，對(duì)鐵（III）進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)相對(duì)誤差絕對(duì)值小于0.5%時(shí)，以下共存離子不干擾測(cè)定：1 000倍的鋇離子、鈣離子、鉀離子、磷酸根離子、鎂離子；500倍的鈉離子、鋅離子、錫離子；250倍的鋁離子、鉛離子、錳離子；50倍的碘離子，10倍的Cr（VI）、Ni²⁺；5倍的se（IV）、Co²⁺；1倍的Cu²⁺。除了等量的Cu²⁺有干擾外，大部分離子允許量較高。本試驗(yàn)加入1.5 mL的1.0 g/L硫脲作掩蔽劑，Cu²⁺的允許量可增加到40倍。

2.8.2樣品中鐵含量的測(cè)定結(jié)果 按照“1.3.9”和“1.3.10”的方法，測(cè)得△A=0.806，根據(jù)鐵溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得牛奶中鐵的含量為0.007 1ug/mL。

2.8.3重現(xiàn)性的測(cè)定 按照“1.3.11”的方法進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，結(jié)果（表1）表明，6組樣品測(cè)定結(jié)果變異系數(shù)為6.85%，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.8.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 按照“1.3.12”的方法進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，溶液放置時(shí)間在較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，穩(wěn)定性較好。

2.8.5回收率的試驗(yàn) 按照“1.3.13”的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果（表3）表明，回收率為85.0%～89.0%。

2.8.6原子吸收法測(cè)牛奶樣品中的鐵

按照“1.3.14”的方法，得到原子吸收法Fe的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.185 6x-0.029 3（r=0.993 9，極顯著）。按照“1.3.15”的方法，測(cè)得△A=0.086。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算鐵的含量為0.618 9ug/mL，換算出所測(cè)牛奶中鐵的含量為0.006 3ug/mL。

3.結(jié)論

雙波長(zhǎng)雙指示劑催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定牛奶中痕量鐵的最佳反應(yīng)條件為鹽酸0.5 mL、亞甲基藍(lán)3 mL、中性紅0.4 mL、3%的雙氧水0.5 mL、反應(yīng)時(shí)間8 min，反應(yīng)在沸水浴中進(jìn)行。對(duì)于相同樣品，用原子吸收法測(cè)得的鐵含量為0.006 3ug/mL，用雙波長(zhǎng)催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)得的鐵的含量為0.0071ug/mL。本試驗(yàn)方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均較好，儀器比較穩(wěn)定，回收率較高，省事、省時(shí)、省力，操作安全，可用于痕量鐵的測(cè)定。