細菌毒力與細菌數(shù)量對雞胚致死率的影響

李筱筱　高霞　康燕青　張皎皎　樊琛　鄭煥芹

摘要：將不同來源的雞大腸桿菌梯度稀釋后進行雞胚致死率試驗，探討細菌毒力與細菌數(shù)量對雞胚致死率的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌菌數(shù)在100～1 000CFU范圍內(nèi)，菌數(shù)與其致病力間相關(guān)性不顯著（P>0.05），雞胚死亡率表現(xiàn)為菌株毒力的影響。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌：細菌數(shù)量：致病性

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的雞感染性疾病的總稱，是養(yǎng)雞生產(chǎn)中常見的一種傳染病，易給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。菌株致病性通常采用雛雞致死率檢測，其結(jié)果受環(huán)境影響大，若采用雞胚代替雛雞，對環(huán)境條件要求低，本試驗探討了通過雞胚致死率檢測雞大腸桿菌致病性的可行性。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源 SD5、SD6、SD24、SD26、SD27、SD30、SD31、SL3共8株采集于山東地區(qū)健康雞糞便：cvcc1551、cvcc1553、cvcc1562、cvcc1568、01、078購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；02、新大、田大、北京1、北京3、貴州1分別為來自北京、黑龍江省、貴州省3個發(fā)病雞場分離的強毒株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室保存；E1、E4、HLl、HL3、HL6、HL7、HL8、HL9、HL10、HL12、HL13、HL16、HL19、HL21、HL22、HL23、HL24、HL25、HL27、HL28、HL29、HL30、HL32、HL33、HL34共25株菌株從外觀健康的不同雛雞糞便中分離鑒定獲得，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室保存；BL21、TG1為感受態(tài)細菌。

1.1.2試劑 伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、生化試驗鑒定管、各種生物化學(xué)試劑均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3試驗動物 12日齡SPF雞胚購于聊城陽谷。

1.2方法

1.2.1大腸桿菌的活化 按文獻[2]方法進行，在無菌的條件下取待測的大腸桿菌，用接種環(huán)挑取平板上的單菌落，在普通營養(yǎng)肉湯中37℃搖床過夜培養(yǎng)10～12h至成熟期。

1.2.2大腸桿菌梯度試驗 取高致病性菌株02和感受態(tài)菌株TG1，1000μL菌液4 000 r/min離心2 min，棄去上清液，取沉淀用生理鹽水清洗2次，進行10倍倍比稀釋。取0.1 mL稀釋液經(jīng)尿囊腔注射12日齡SPF雞胚，每組10只，同時取0.1 mL稀釋液涂板，做細菌計數(shù)。并做對照組，注射生理鹽水，共注射10只。然后于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記錄每天的死亡數(shù)，至第四天，記錄胚胎的死亡率。

1.2.3細菌數(shù)量與雞胚致死率相關(guān)性試驗 取47株不同來源的雞大腸桿菌的菌液1 000μL，4 000r/min離心2 min，棄去上清液，取沉淀用生理鹽水清洗2次，稀釋至細菌數(shù)100-1 000 CFU。按“1.2.2”方法進行雞胚致病性試驗并記錄結(jié)果，判斷細菌數(shù)在100～1 000 CFU范圍時，細菌數(shù)量與雞胚致死率的相關(guān)性。

1.2.4不同來源的雞大腸桿菌毒力試驗 分別取高致病性菌株01、02、078、cvccl551、cveel553、cvc1562、cvee1568和非致病菌株BL21、TG1、E4，按“1.2.2”方法進行雞胚致病性試驗，記錄雞胚的死亡率。

1.2.5重復(fù)性試驗 10 d后，選取HL22、HL24、E1、02、TG1，按“1.2.2”方法進行重復(fù)性試驗。

2.結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌梯度試驗

由表1可知，高致病性菌株02菌數(shù)在10³～10⁵CFU范圍內(nèi)時，雞胚死亡率隨著菌數(shù)的升高而降低，其菌數(shù)在8-490 CFU范圍內(nèi)雞胚死亡率隨菌數(shù)的升高而升高：對于感受態(tài)菌株TG1，其菌數(shù)在10³～10⁶CFU范圍內(nèi)雞胚死亡率隨菌數(shù)的升高而降低，在10～10⁴CFU范圍內(nèi)雞胚死亡率隨菌數(shù)的升高而升高。注射生理鹽水的對照組雞胚在觀察時間內(nèi)沒有死亡。結(jié)果表明，細菌菌數(shù)在100～1 000CFU范圍內(nèi)，高致病性菌株的雞胚死亡率高達80%：而感受態(tài)菌株的雞胚死亡率最高為30%，即注射菌數(shù)在100～1 000CFU范圍內(nèi)可區(qū)分高致病性菌株與無（或低）致病性菌株。

2.2細菌數(shù)量與雞胚致死率相關(guān)性試驗結(jié)果

各組雞胚接種細菌后，胚胎死亡多集中于接種后的第二天和第三天，注射生理鹽水的對照組雞胚在觀察時間內(nèi)沒有死亡，見表2。經(jīng)Spss軟件分析，大腸桿菌的菌數(shù)與其致病力間相關(guān)性不顯著（P=0.590>0.05）。即注射大腸桿菌菌數(shù)在100～1 000CFU范圍時，雞胚致死率與注射菌數(shù)不相關(guān)。

2.3不同來源的雞大腸桿菌毒力試驗結(jié)果

高致病性菌株雞胚死亡率高達40%-80%：而非致病性菌株的死亡率為0%～30%，注射生理鹽水的對照組雞胚在觀察時間內(nèi)均無死亡（表3）。由表2和表3可見，大腸桿菌菌數(shù)在100-1 000 CFU范圍內(nèi)時，雞胚致死率與菌數(shù)不相關(guān)，與細菌毒力相關(guān)。

2.4重復(fù)性試驗結(jié)果

在菌數(shù)100-1 000 CFU范圍內(nèi)，各菌株的雞胚致死率變化幅度均在20%內(nèi)，即重復(fù)性可接受，見表4。重復(fù)性試驗結(jié)果進一步表明，雞大腸桿菌菌數(shù)在100～1 000 CFU范圍內(nèi)與雞胚致死率不相關(guān)，即雞胚致死率表現(xiàn)為大腸桿菌毒力而非菌數(shù)的影響。雞胚致死試驗可反映大腸埃希菌的毒力強弱，即雞胚致死率可作為檢驗雞大腸埃希菌致病力強弱的一種方法。

3.討論

為探討大腸桿菌毒力與細菌數(shù)量對雞胚致死率的影響，采用雞胚注射的方法。致死率試驗通常選擇小鼠、家兔、雞等試驗動物。將動物隨機分組，同時設(shè)對照組和攻毒組，在試驗期內(nèi)觀察動物死亡情況。如李玉文等在遼寧省禽大腸埃希氏菌血清型的調(diào)查及其致病性試驗中，對300只1日齡SPF雛雞于氣管內(nèi)注射并觀察7 d，結(jié)果表明，給每只試驗雞于氣管內(nèi)接種0.1 mL培養(yǎng)物后第12 h試驗雞主要表現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、喘氣、垂翅、豎毛、食欲下降或廢食，或排灰白色稀便。高致病性分離株引起接種雞死亡的高峰在接種后第12～24 h。所有分離菌株均有致病性。高崧等在中國部分地區(qū)禽病原性大腸桿菌分離與鑒定中，以每分離株107菌落形成單位（CFU）細菌氣管內(nèi)接種1日齡無特定病原體（SPF）雞6羽，根據(jù)接種后7 d內(nèi)發(fā)生死亡和病變雞的比例，確定出高致病株、中度致病株和低致病株分別為83.33%、10.00%、6.67%。高致病性分離株引起接種雞死亡高峰在12～24 h，表明菌株毒力存在差異。此方法應(yīng)用較多，雖然能夠模擬細菌攻毒的機制，但存在占地大、受環(huán)境影響明顯，成本高，飼養(yǎng)條件不易控制等因素。雞胚致死試驗國內(nèi)外相關(guān)研究資料較少，本試驗采用雞胚代替雛雞，對環(huán)境條件要求低，占地少。結(jié)果顯示，采取雞胚致死率作為檢測雞大腸桿菌致病性的方法是可行的。樊琛等在把雞胚致死率作為檢驗雞大腸埃希菌致病力指標的探討中采用SPF級12日齡雞胚和1日齡公雛雞分別接種雞大腸埃希菌，檢測20株雞大腸埃希菌菌株對12日齡雞胚和1日齡公雛雞的致死率的相關(guān)性，結(jié)果顯示雛雞致死率與雞胚致死率相關(guān)。雞胚致死試驗可反映出大腸埃希菌的毒力強弱，即雞胚致死率可作為檢驗雞大腸埃希菌致病力強弱的一種方法。雛雞致死率與雞胚致死率有相關(guān)性。盡管細菌對雞胚的致死機制還不清楚，可能其致死機制與細菌在人體和動物體中的致病機制不同，但雞胚致死率仍與細菌毒力相關(guān)。

試驗先通過對已知的高致病性菌株02和感受態(tài)菌株TG1進行梯度試驗，結(jié)果顯示，細菌菌數(shù)在100-1 000 CFU范圍內(nèi)，菌數(shù)與死亡率不相關(guān)。再隨機選取47株不同來源的雞大腸桿菌，控制其菌數(shù)在100～1 000CFU范圍內(nèi)對12日齡SPF雞胚進行致病性試驗，經(jīng)Spss軟件分析，P=0.590>0.05，即進一步表明大腸桿菌菌數(shù)在合理的范圍內(nèi)與雞胚致死率無關(guān)。并通過多數(shù)胚胎致死試驗表明，活菌數(shù)在100～500CFU之間的注射量變化對胚胎的死亡率沒有明顯影響。同時，對10株不同來源的高致病性菌株與非致病性菌株進行雞胚致死率試驗，結(jié)果顯示，在控制菌數(shù)100-1 000 CFU范圍內(nèi)的條件下，雞胚死亡率表現(xiàn)為菌株毒力的影響。高致病性菌株雞胚死亡率高達40%～80%：而非致病性菌株的死亡率為0%-30%，不同大腸桿菌分離株的致病性存在明顯的差異。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，在菌數(shù)100-1 000CFU范圍內(nèi)，各菌株的雞胚致死率變化幅度均在20%內(nèi)。Penelop等采用在間隔一周的時間條件下，對菌數(shù)和胚胎死亡率進行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，胚胎死亡數(shù)量的變化發(fā)生在重復(fù)性試驗中，即在0%-40%范圍內(nèi)這種重復(fù)性是可接受的。大腸桿菌菌數(shù)在100～1 000 CFU之間的注射量變化對胚胎的死亡率沒有明顯的影響。雞胚致死率表現(xiàn)為大腸桿菌毒力的影響而非菌數(shù)的影響，雞胚致死試驗可反映出大腸埃希菌的毒力強弱，即雞胚致死率可作為檢驗雞大腸埃希菌致病力強弱的一種方法。