棉花種子純度快速檢測技術(shù)

錢雯婕　袁青鋒　魏紅英

摘要 介紹了一種利用棉花種子通用DNA快速提取方法以及多重PCR技術(shù)實現(xiàn)其純度快速檢測的技術(shù)。由于該技術(shù)具備準確、高效、成本低，以及便于推廣應用的特點，實現(xiàn)了棉花種子純度的快速檢測。

關(guān)鍵詞 棉花種子；PCR；快速檢測

中圖分類號 S562 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）07-0056-01

棉花是我國重要經(jīng)濟作物之一，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展發(fā)揮了重要促進作用。自我國成功加入WTO組織之后，棉花出口量逐年遞增，對其產(chǎn)量、品質(zhì)均提出了更高的要求。棉花的種子是棉花生產(chǎn)的基礎(chǔ)，種子純度是衡量質(zhì)量的主要標準，棉種質(zhì)量的高低是決定該品種能否在生產(chǎn)上推廣、應用的前提，也是棉種生產(chǎn)及其推廣應用的生命線[1-2]。種子純度作為衡量棉花種子的重要指標之一，不僅影響著企業(yè)對于棉種的購銷，也是企業(yè)能否穩(wěn)健發(fā)展的根本。如何及時準確地鑒定出棉種的純度，一直是棉種行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控的重點和難點。純度鑒定是判定種子質(zhì)量最復雜的檢驗過程。種子純度檢測的方法有很多，傳統(tǒng)鑒定方法為等到種子下一個生長季節(jié)或者到海南省通過種植鑒定，該方法的缺點在于費時費力，且成本較高，無法滿足現(xiàn)代化種子經(jīng)營的步伐[3-4]。隨著DNA標記技術(shù)的逐步成熟，目前已成為鑒定棉花雜家種子純度鑒定方法的補充或有效替代[5-6]。

哈密地處亞歐大陸腹地，位于西風帶控制之下，常年干燥少雨，溫差大，光照時間長，熱量豐富，屬于典型的大陸性半干旱氣候，對棉花等種植業(yè)的發(fā)展極為有利，在新疆棉花氣候資源區(qū)劃上屬宜棉區(qū)。得天獨厚的自然條件，吸引了諸多內(nèi)地廠家來此繁育棉花。在雜交棉花的制種方面，目前多通過人工去雄授粉方法進行，其缺點表現(xiàn)為難免會出現(xiàn)一部分自交現(xiàn)象，導致該現(xiàn)象的誘因有多種：首先是人工去雄不到位，即由于天氣或勞動力等因素所限，導致去雄不徹底；其次是種子純度不高，部分種子經(jīng)銷商在利益驅(qū)使下，在種子中摻雜假種子，嚴重影響種子純度；最后，由于棉花自身具備一定天然異交率，容易造成品種混亂。對于棉花生產(chǎn)來說，如果不能有效鑒定棉種的純度，將嚴重影響棉花產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，如果能夠探索出一種精準、高效、經(jīng)濟的棉種純度檢測技術(shù)，可對雜交棉的種植及推廣起到積極的促進作用[7-8]。

本文通過將棉花種子DNA快速提取方法和通用多重PCR技術(shù)結(jié)合起來，實現(xiàn)提高棉花種子純度鑒定效率的同時，也極大地提升新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十三師農(nóng)業(yè)科學研究所科研技術(shù)服務能力，對促進哈密地區(qū)及十三師現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展有著重要的意義?，F(xiàn)將棉花種子純度快速檢測技術(shù)研究的具體實施方案介紹如下。

1 引物設(shè)計

根據(jù)Cotton Microsatellite Database（CMD）已公布的序列，以及兩端序列的保守性，設(shè)計多對引物。在設(shè)計引物的過程中，要充分考慮引物的差異性、Tm值、長度、GC含量等。

2 DNA提取方法

本試驗采用改良的CTAB法提、SDS法、試劑盒快速提取法分別提取棉花種仁和子葉DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，分光光度法測定DNA濃度和純度，篩選出最優(yōu)的提取部位和提取方法。建立一種基于PCR的棉花種子DNA快速提取方法，并經(jīng)過多組試驗，深入研究提取方法所涉及因素（如提取液體積、濃度、提取時間等）對DNA完整性以及PCR產(chǎn)物的影響，以及不同公司的Mix以及DNA模板量存在差異性的情況下對PCR產(chǎn)物的影響，最終研究出一種基于PCR的棉花種子DNA快速提取方法。

3 多重PCR技術(shù)

通過深入研究多重PCR技術(shù)，多方面、多維度對引物設(shè)計、PCR擴增體系以及PCR擴增程序進行深入思考，并對其技術(shù)可行性進行縝密論證，最終建立起一套通用多重PCR技術(shù)。

4 擴增產(chǎn)物的PAGE與銀染檢測

經(jīng)過PCR擴增完成并且經(jīng)過變性以后，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，隨后進行銀染檢測，再根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型統(tǒng)計母本自交粒帶型數(shù)量、待測樣品目標帶型數(shù)量，以及雜粒帶型數(shù)量，最終計算出待測樣品的純度，亦可根據(jù)其他PCR產(chǎn)物檢測儀器的參數(shù)計算待測樣品純度[9-11]。

5 參考文獻

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