BIOLOG在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應(yīng)用

湯朋先　荊英　徐志英

摘 要 一直以來，微生物的研究人員都無法解決關(guān)于微生物群落實驗中的一些技術(shù)問題。BIOLOG技術(shù)的出現(xiàn)，為研究人員提供了新的研究思路。為了更好地描述土壤的微生物群落所具有的多樣性功能，生物學(xué)家致力于對該實驗的研究。BIOLOG技術(shù)是一種比較簡單且快捷的研究方法，能夠為研究人員提供比較基礎(chǔ)的培養(yǎng)方法，使微生物在實驗中反映出微生物群落的代謝多樣性。筆者從BIOLOG技術(shù)釋義角度出發(fā)，深入研究了實驗研究的相關(guān)原理，找出了實驗中將會存在的問題，并給出了合理的解決措施，期望能夠為土壤的微生物群落實驗提供借鑒。

關(guān)鍵詞 BIOLOG技術(shù)；土壤；微生物群落；功能多樣性；應(yīng)用分析

中圖分類號：S714.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.144

近年來，生物學(xué)家在土壤方面的微生物群落的相關(guān)研究中采用BIOLOG技術(shù)，該種技術(shù)有助于提高生物反應(yīng)的靈敏度，并促使研究人員能夠更加清楚地分辨這些變化。而在BIOLOG技術(shù)下的微生物研究不需要采用分離的方式來培養(yǎng)純種的微生物，能夠保留住微生物的群落原有的特性。研究人員在BIOLOG技術(shù)的支持下清晰地記錄下生物反應(yīng)的相關(guān)數(shù)據(jù)，并在計算機中存儲研究數(shù)據(jù)及研究結(jié)果。該種技術(shù)能夠在很大程度上提高研究人員的研究效率，并使微生物研究的成功率提高。

1 BIOLOG技術(shù)釋義

BIOLOG技術(shù)是由美國一家叫做BIOLOG的公司在1989年開始研發(fā)的，當(dāng)時該公司將95種唯一碳源放在一起，進(jìn)行了生物化學(xué)反應(yīng)的相關(guān)測試。而該技術(shù)就是在該種研究中被應(yīng)用[1]。BIOLOG技術(shù)最早用于對純種的微生物鑒定。后來研究人員已經(jīng)能夠體會BIOLOG技術(shù)在生物研究中所帶來的益處，將該技術(shù)運用到更多的領(lǐng)域當(dāng)中。如今，BIOLOG技術(shù)已經(jīng)能夠用于鑒定細(xì)菌、霉菌等多種病原微生物。Garland和Mill兩位生物研究人員在1991年將BIOLOG技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域再一次拓展，在土壤的微生物研究中采用了該種技術(shù)，并研究了微生物的群落是怎樣的生物反應(yīng)。

2 BIOLOG技術(shù)在土壤的微生物群落的功能研究原理

BIOLOG技術(shù)的研究載體是一個擁有多達(dá)96個孔洞的微孔板。在研究的過程中，研究人員通常會將其中的95個孔都加入不同的單一碳源并在其中添加四唑染料。那么，在微孔板中還剩余一個孔，研究人員利用剩余的一個孔進(jìn)行對照試驗，在保障該孔洞不被加入碳源的同時，加入適量的水，以此來觀察該對照孔洞與其他孔洞的不同[2]。在微生物與該微孔板連接時，微生物將會與孔洞中的原料發(fā)生不同的反應(yīng)。其中添加了碳源的孔洞將會產(chǎn)生氧化還原現(xiàn)象，而孔洞中的四唑染料也將在微生物的作用下變成紫色。此實驗?zāi)軌驗檠芯咳藛T提供一定的數(shù)據(jù)，表示該微生物能夠利用該種碳源。BIOLOG技術(shù)已經(jīng)建立了包括1 449種細(xì)菌信息的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫能夠為利用BIOLOG技術(shù)的研究人員提供關(guān)于鑒定微生物是否被分離純化的結(jié)果信息。而當(dāng)Garland和Mill兩位研究人員將該技術(shù)運用到土壤的微生物研究中時，BIOLOG技術(shù)將以相似的原理來顯示關(guān)于土壤微生物的群落多功能性的鑒定結(jié)果，并幫助研究人員分析土壤的微生物群落是否存在代謝多樣化的現(xiàn)象。

3 BIOLOG技術(shù)在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中存在的問題

基于BIOLOG技術(shù)的突然微生物的功能多樣性研究盡管在很早以前就已經(jīng)有研究人員研究實驗，但時至今日，該研究還是會存在著一定的問題。

在對土壤的微生物群落研究當(dāng)中，研究人員需要根據(jù)不同產(chǎn)生地點或者在同一地點，但在不同時間產(chǎn)生的微生物的物種來進(jìn)行不同BIOLOG技術(shù)下微孔板的相關(guān)實驗[3]。在實驗當(dāng)中，微孔板中不同的培養(yǎng)基其微生物的細(xì)胞活躍度也將產(chǎn)生不同的反應(yīng)。而研究人員不僅需要清晰且有規(guī)律地記錄下每種反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)，還要觀察微孔板中不同孔洞的四唑染料顏色變化，如此才能正確判斷出土壤的微生物群落的功能。當(dāng)然，在土壤的微生物群落實驗當(dāng)中并不能很容易地判斷實驗結(jié)果，多種微生物在不同的微孔板中其顏色反應(yīng)及其他的生物細(xì)胞反應(yīng)都不一樣，也不是研究人員通過將數(shù)據(jù)簡單的相加就能夠計算出不同的生物群落所具有的功能性。這些反應(yīng)的密度十分大，研究人員需要時刻的觀察該類反應(yīng)的變化，而細(xì)胞本身是非常微小的事物，其變化的時間不確定，不同的培養(yǎng)基內(nèi)的微生物變化現(xiàn)象也不同。因此，研究人員在BIOLOG技術(shù)下的土壤微生物研究會產(chǎn)生諸多問題。

一些研究人員會因為來不及觀察培養(yǎng)基中微生物的細(xì)微變化，而使實驗數(shù)據(jù)記錄出現(xiàn)錯誤，有些研究可能會由于研究過程中的相關(guān)物質(zhì)添加不準(zhǔn)確而造成實驗失去意義[4]。實驗過程中還可能引發(fā)的問題是研究人員來不及確定培養(yǎng)基的時間度讀數(shù)，因此而錯過了微孔板中一些孔洞的顏色變化。在土壤的微生物研究當(dāng)中，BIOLOG技術(shù)下對于微孔板的接種密度將影響到整個研究的結(jié)果。而一旦對于微孔板中的孔洞接種密度存在了差異，就會使微生物與碳源之間的反映出現(xiàn)不同的表現(xiàn)結(jié)果。

4 BIOLOG技術(shù)在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中問題的解決方法

要想解決BIOLOG技術(shù)在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中的問題，研究人員首先要把握住整個BIOLOG技術(shù)的操作要點。從土壤的樣品采集以及其接種實驗的方面考慮，需要考慮到群落的相關(guān)變異[5]。設(shè)置多種驗證群落變異的相關(guān)實驗，盡量采用多次處理的方式來進(jìn)行取樣。將取得的樣品放置到一起，以免因為樣品的防止地點不同，而使樣品存在差異。而在取出單個樣品時，研究人員需要采用滅菌的形式加入磷酸的緩沖液。依次將樣品放入到接種的板中。研究人員需要對樣品接種過程中的讀數(shù)進(jìn)行糾正，以避免初始時間的讀數(shù)錯誤。從微孔板的培養(yǎng)步驟考慮，在BIOLOG技術(shù)下，將細(xì)菌版防止在固定的溫度當(dāng)中，避免因為溫度變化而帶來的細(xì)菌變異。微孔板的固定培養(yǎng)溫度需要是在15～28。C[6]。關(guān)于微孔板讀數(shù)的相關(guān)操作，需要掌握讀數(shù)的波長以及數(shù)據(jù)的光密度，確保在590 nm的波長下對微孔板進(jìn)行監(jiān)測，并掌握平均的孔顏色。由于土壤微生物的群落研究需要進(jìn)行多種研究，所以研究人員需要注意數(shù)據(jù)的分析和激勵。在眾多的數(shù)據(jù)當(dāng)中，研究人員需要掌握更為科學(xué)的數(shù)據(jù)分析方法，從而進(jìn)行主成分的分析及聚類的分析。

在進(jìn)行土壤的微生物群落實驗時，除了要對以上問題進(jìn)行注意并糾正以外，還需要在微孔板的培養(yǎng)過程中注意96個孔的原始差異，并對不同孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)致的激勵，確保研究人員能夠觀察出在單一碳源的影響下，不同的樣品的功能差異。而在實驗當(dāng)中接種密度已經(jīng)為研究人員的實驗帶來的難題，但只要研究人員注意孔洞的實驗數(shù)據(jù)變化，就能夠緩解由于密度過大而帶來的顏色擴展影響，從而使研究人員更容易分辨出微孔板中不同孔中的樣品反映。在讀數(shù)的過程中，研究人員也要固定水平的AWCD，如此讀出的數(shù)值能夠與微孔板的數(shù)值進(jìn)行對比，從而使研究人員能夠?qū)ξ⒖装鍍?nèi)的數(shù)值進(jìn)行重復(fù)讀數(shù)。只要研究人員根據(jù)多次讀數(shù)的數(shù)值篩選出接近水平AWCD所讀出的數(shù)值，就能夠作為實驗的參考數(shù)值來參與數(shù)據(jù)的分析[7]。此種方法能夠有效的減少實驗結(jié)果的差異，并使研究人員更輕易的完成讀數(shù)的工作。當(dāng)然，要想排除接種過程中所產(chǎn)生的差異問題，研究人員也可以在接種之前將濃度調(diào)節(jié)到接近一致的數(shù)值，以此來減小接種過程中所存在的差異。但該種方式并不適用于所有的土壤微生物群落實驗。

利用上述方法，研究人員能夠更加了解實驗的對象及實驗的密度，并可以抑制微生物的差異性產(chǎn)生。研究人員嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鲗嶒灢襟E，避免盲目轉(zhuǎn)換實驗數(shù)值，使接種密度以及光密度都保持在一定的數(shù)值內(nèi)，完成了對土壤微生物群落的實驗，排除了實驗中存在的關(guān)鍵性技術(shù)問題，使實驗結(jié)果更加真實。

5 結(jié)論

盡管基于BIOLOG技術(shù)的土壤微生物的群落實驗還有一些遺留問題需要研究，但其功能的多樣性已經(jīng)能夠在BIOLOG技術(shù)的支持下被研究人員實驗出來。相信只要研究人員克服了在研究中的技術(shù)問題，并保持對實驗的嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度，就能夠得出最真實的實驗結(jié)果。而BIOLOG技術(shù)也將不再局限于土壤的微生物群落實驗當(dāng)中，而是向著更為廣闊的領(lǐng)域發(fā)展，從而體現(xiàn)BIOLOG技術(shù)的真正價值。

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（責(zé)任編輯：劉昀）