食品中氯霉素類藥物殘留量檢測(cè)方法研究進(jìn)展

馬燕紅 李志剛 陳超

摘 要：氯霉素類是一種禁止在食用動(dòng)物中應(yīng)用的抗生素類藥物，其殘留將會(huì)影響人體健康和動(dòng)物性食品的出口貿(mào)易。本文綜述了氯霉素類藥物在食品中的檢測(cè)方法，主要有微生物法、儀器法（色譜法、電化學(xué)法、光度法）、免疫分析方法、傳感器法、分子印跡法、生物芯片法等，并分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，最后對(duì)氯霉素類藥物殘留檢測(cè)方法的趨勢(shì)進(jìn)行展望。以期對(duì)我國(guó)食品（尤其是動(dòng)物性食品）中氯霉素類藥物的殘留檢測(cè)方法提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：氯霉素類藥物；食品；檢測(cè)方法

An Overview on Analytical Methods for the Multiresidue Detection of Chloramphenicols in Food Products

MA Yanhong， LI Zhigang， CHEN Chao

（China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： Chloramphenicols are a group of antibiotics which have been banned from use in food-producing animals. The chloramphenicol residues in animal origin food products will have a detrimental influence on human health and on the export trade of animal origin food products. The main detection methods for chloramphenicols， including microbiological， instrumental （chromatographic， electrochemical and spectrophotometric）， immunoassay， sensor， molecular imprinting and biochip methods， are summarized and analyzed in this review. Furthermore， further development of new analytical methods for the detection of chloramphenicols is discussed. We hope that this review will provide technical supports to promote the detection of chloramphenicols in foods （especially animal-derived foods）.

Key words： chloramphenicols； food； detection methods

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.008

中圖分類號(hào)：TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）07-0035-04

引文格式：

馬燕紅， 李志剛， 陳超. 食品中氯霉素類藥物殘留量檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2016， 30（7）： 35-38. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.008. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

MA Yanhong， LI Zhigang， CHEN Chao. An overview on analytical methods for the multiresidue detection of chloramphenicols in food products[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 35-38. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.008. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平日益提高，人們對(duì)食品的安全問(wèn)題更加重視。食品中的藥殘、農(nóng)殘等問(wèn)題是食品衛(wèi)生安全的重要問(wèn)題之一。氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑制作用，常被用于各種動(dòng)物性傳染疾病的治療，常見(jiàn)的藥物主要包括氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考或氟甲砜霉素（florfenicol，F(xiàn)F）等。

毒理學(xué)研究表明，氯霉素可抑制骨髓細(xì)胞內(nèi)線粒體蛋白質(zhì)的合成，對(duì)人和動(dòng)物骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，能引起再生障礙性貧血，并伴有白細(xì)胞和血小板減少現(xiàn)象，新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等，還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性，威脅人類的健康。甲砜霉素能抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的生成，其毒性低于氯霉素。氟苯尼考的抗菌活性優(yōu)于前兩者，雖不會(huì)引起骨髓抑制、再生障礙性貧血和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，但具有胚胎毒性[1]。因此，歐盟、美國(guó)、我國(guó)及其他國(guó)家嚴(yán)禁這類藥物在食用動(dòng)物上使用，并不斷改進(jìn)其檢測(cè)方法，檢出限也逐漸減低。但這類藥物價(jià)格低廉、抑菌效果好，仍有不法商販違法使用。為了廣大消費(fèi)者的健康及保護(hù)我國(guó)動(dòng)物性食品的出口貿(mào)易，一直以來(lái)，研究氯霉素類化合物的檢測(cè)方法都是食品行業(yè)的熱點(diǎn)。到目前為止，國(guó)內(nèi)外用于氯霉素類化合物的檢測(cè)方法已近十幾種，本文就此做一簡(jiǎn)要概述。

1 微生物法

微生物法檢測(cè)氯霉素類藥物的原理是根據(jù)其對(duì)微生物有抑制作用，從而對(duì)樣品中殘留的藥物進(jìn)行定性及定量的檢測(cè)。包括棉簽法、杯碟法、紙片法、瓊脂擴(kuò)散法、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）法和BBRT法[2]。宋杰等[3]采用棉簽法和發(fā)酵法對(duì)牛乳中的氯霉素進(jìn)行了檢測(cè)，根據(jù)氯霉素對(duì)短小芽孢桿菌形成清晰的抑菌環(huán)，可以定性的判斷氯霉素的有無(wú)。

檢測(cè)氯霉素在水產(chǎn)品中的殘留情況。氯霉素對(duì)所確立的發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)體系的發(fā)光有明顯的抑制效應(yīng)，由此建立了氯霉素質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與其發(fā)光細(xì)菌發(fā)光抑制效應(yīng)的線性關(guān)系。所建方法的線性范圍為0.1～1.0 ng/mL，回收率在40.34%～114.26%，檢測(cè)限為0.1 ng/mL。

微生物檢測(cè)法簡(jiǎn)單、快速，在定性篩選工作中表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，但耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性和專一性低，易漏檢，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

2 儀器法

2.1 樣品前處理

食品成分復(fù)雜，含有如蛋白質(zhì)、脂肪、糖、維生素、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)。而獸藥殘留量往往較低，基質(zhì)效應(yīng)不僅對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)帶來(lái)干擾，還會(huì)污染儀器并降低設(shè)備的使用壽命。對(duì)于食品中獸藥殘留量的檢測(cè)，前處理過(guò)程通常包括提取、凈化、濃縮或衍生化等處理方式。

氯霉素類藥物屬于弱極性物質(zhì)，在水中溶解度較差，易溶于有機(jī)溶劑。對(duì)于動(dòng)物源性食品，大多用乙酸乙酯經(jīng)超聲、均質(zhì)、振蕩等方式來(lái)提取氯霉素類藥物，濃縮至近干，再用水或鹽溶解，正己烷去脂，固相萃取小柱凈化后，上液相色譜或液-質(zhì)聯(lián)用儀分析；采用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用分析時(shí)還要加衍生化的步驟。馬素英等[5]測(cè)定了豬可食組織中氯霉素和甲砜霉素殘留量，先用乙酸乙酯超聲提取樣品，蒸干后用4%氯化鈉溶解，正己烷去脂，再過(guò)C18固相萃取柱凈化，然后用衍生化試劑將氯霉素衍生化，用正己烷復(fù)溶，進(jìn)氣相色譜儀分析。

潘瑩宇等[6]測(cè)定了牛乳中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯超聲提取，氯化鈉溶解，正己烷去脂，再進(jìn)行熒光衍生化反應(yīng)后供液相色譜分析。

2.2 儀器法測(cè)定

2.2.1 色譜法

色譜法是氯霉素類化合物殘留分析中報(bào)道最多的方法，主要包括薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法。

2.2.1.1 薄層色譜法

Abjean[7]建立了薄層色譜法檢測(cè)豬肉中氯霉素殘留的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、正己烷脫脂、硅膠柱凈化濃縮后，用甲醇溶解，點(diǎn)樣，用乙酸乙酯-正己烷體系展開(kāi)。再將斑點(diǎn)進(jìn)行衍生化產(chǎn)生熒光，進(jìn)行紫外檢測(cè)。此方法雖然儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，但樣品處理過(guò)程復(fù)雜，顯色過(guò)程也比較復(fù)雜。

2.2.1.2 氣相色譜法

Jacobson等[8]最早提出了氯霉素的氣相色譜檢測(cè)方法。王鋒等[9]建立了蝦中氯霉素殘留的電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜方法，氯霉素質(zhì)量濃度在0.5～500 μg/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所建立方法靈敏、精密度高。馬素英等[5]建立了同時(shí)檢測(cè)豬可食組織中氯霉素和甲砜霉素殘留的氣相色譜方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、離心、蒸發(fā)、氯化鈉溶液溶解，C18固相萃取小柱凈化、收集、衍生化等步驟，終產(chǎn)物用氣相色譜法分析。所建立的方法氯霉素和甲砜霉素在10～640 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.5 μg/kg。

2.2.1.3 液相色譜法

高效液相色譜法的靈敏度較高，重復(fù)性好。陳晉旭[10]建立了高效液相色譜法測(cè)定小龍蝦中氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)Fa）殘留量的檢測(cè)方法。利用甲醇作為提取溶劑和蛋白沉淀劑，測(cè)定CAP、FF和FFa的含量，CAP在1～400 μg/kg、FF在20～2 000 μg/kg、FFa在10～2 000 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法的最低檢出限為CAP 1 μg/kg、FF 20 μg/kg、FFa 20 μg/kg。

潘瑩宇等[6]建立了高效液相色譜-熒光法檢測(cè)牛乳中氯霉素殘留量的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，與熒光胺發(fā)生衍生化反應(yīng)，用熒光檢測(cè)器定量檢測(cè)。該方法的線性范圍在0.4～800 μg/L，檢出限為0.2 μg/L，回收率在66.6%～92.8%之間，具有干擾小、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.1.4 質(zhì)譜法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)。主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometer， GC-MS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）法。

GB/T 22338—2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》中氯霉素類藥物的檢測(cè)方法采用GC-MS和LC-MS/MS[11]。氣相色譜法采用負(fù)化學(xué)源，靈敏度較高，CAP的檢出限為0.1 μg/kg，F(xiàn)F和TAP的檢出限為0.5 μg/kg。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法三者的檢出限均為0.1 μg/kg。

孫雷等[1]建立了牛乳、豬肝、豬肉中CAP、TAP、FF和FFa殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。采用堿性的乙酸乙酯提取藥物殘留，再用正己烷去除基質(zhì)中的脂肪，省去了固相萃取的步驟。所建方法在2～500 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，4 種化合物的平均回收率均為70%～120%。

劉紅云[12]用氣質(zhì)法測(cè)定了飼料中的氯霉素，采用乙酸乙酯和磷酸鹽緩沖溶液提取飼料中的氯霉素，用C18柱進(jìn)行凈化，之后用N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷（timethyl chlorosilane，TMCS）（99∶1，V/V）進(jìn)行衍生化，再用氣相色譜-質(zhì)譜分析。方法的檢出限為0.1 μg/kg。

Pan Xiaodong等[13]建立了魚(yú)肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的基質(zhì)-固相分散-超高效液相色譜（matrix solid phase dispersion-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，MSPD-UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。將2 g樣品與3 g C18柱填料混合均勻后填至300 mm×15 mm的玻璃小柱，用8 mL正已烷淋洗，10 mL乙腈-水（50∶50，V/V）洗脫至離心管中，再用乙酸乙酯分2 次萃取，乙酸乙酯層氮吹干，最后用甲醇-水（10∶90，V/V）復(fù)溶，過(guò)膜，上機(jī)。該方法在CAP和FF的檢測(cè)限為0.02 μg/kg、TAP的檢測(cè)限為0.06 μg/kg，回收率在84.2%～99.8%之間。

采用色譜分析具有準(zhǔn)確、靈敏、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理復(fù)雜、需要大型精密儀器、檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且氣相和氣質(zhì)法還需衍生化，更增加了檢測(cè)的復(fù)雜程度。

2.2.2 電化學(xué)法

Zhai Haiyun等[14]用示差脈沖溶出伏安法測(cè)定了氯霉素的殘留量，合成的銀納米材料/磺化的石墨烯修飾玻璃碳電極（AgNPs/SF-GR/GCE）可以電解還原氯霉素，在pH 4的檸檬酸緩沖液體系下考察了不同脈沖電壓對(duì)氯霉素測(cè)定的影響。該方法氯霉素的檢出限為0.01 μmol/L。

陳天豹等[15]用毛細(xì)管電泳法分析了氯霉素和其他4 種抗生素，優(yōu)化了抗生素分離的條件，成功的應(yīng)用于蜂蜜中殘留抗生素的測(cè)定，氯霉素的檢測(cè)限為10 μg/L，回收率大于89.6%。

張燦等[16]建立了一種毛細(xì)管電泳免疫方法快速檢測(cè)氯霉素，該方法結(jié)合了免疫分析的特異性和毛細(xì)管電泳快速高效分離分析的優(yōu)勢(shì)。氯霉素檢測(cè)的線性范圍為0.008～5 ng/mL，最低檢出限為0.001 6 ng/mL。對(duì)動(dòng)物源性食品分析，實(shí)際樣品中的檢測(cè)限為0.035 μg/kg。

2.2.3 光度法

潘瑩宇等[17]研究了氯霉素?zé)晒庋苌磻?yīng)的實(shí)驗(yàn)條件，采用熒光分光光度法測(cè)定了牛乳中氯霉素的殘留量。牛乳經(jīng)乙酸乙酯超聲提取3 次，濃縮、鹽水溶解、正己烷脫脂，再經(jīng)乙酸乙酯反萃取，氮?dú)獯蹈?，還原后用熒光胺衍生化測(cè)定。該方法氯霉素在12.5～500 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回收率為81%～87%。

3 免疫分析法

彭運(yùn)平等[18]應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）檢測(cè)了魚(yú)肉及蜂蜜中氯霉素的殘留量。酶聯(lián)免疫法的測(cè)定原理是在氯霉素全抗原中加入氯霉素抗體，再加入酶標(biāo)記物，用四甲基聯(lián)苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）底物顯色，樣本和標(biāo)準(zhǔn)液中氯霉素含量與吸光度呈反比。氯霉素在0.05～4.05ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回收率在85%以上。此法檢測(cè)快速，樣品前處理簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控及大量樣本的初篩，但也存在假陽(yáng)性的問(wèn)題。

李余動(dòng)等[19]采用膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)法定性測(cè)定了蝦中的氯霉素。張燕等[20]優(yōu)化建立了滲濾式和側(cè)流式2 種金標(biāo)記免疫競(jìng)爭(zhēng)快速篩選方法，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標(biāo)記氯霉素多克隆抗體，以硝酸纖維素膜為載體，包被氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物作為檢測(cè)帶，經(jīng)過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后目測(cè)結(jié)果。2 種方法靈敏度分別為0.8 μg/mL和1 μg/mL。免疫膠體金法快速、靈敏，穩(wěn)定性好，可作為氯霉素殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的有效篩查手段。

4 傳感器法

傳感器是由敏感元件、轉(zhuǎn)換元件及測(cè)量電路組成的能識(shí)別目標(biāo)化合物，并可轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)的器件或裝置[21-22]。傳感器的種類很多，有熒光傳感器[23]、納米傳感器[24]、化學(xué)傳感器[25]、光電化學(xué)傳感器[26]、生物傳感器[27]和免疫傳感器[28]等。

武會(huì)娟等[29]利用pH敏感的熒光指示劑F1300可以量化ATP合酶活性的特點(diǎn)，構(gòu)建生物傳感器，開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)氯霉素殘留的檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)限為10-11 mg/mL，

能快速高靈敏地檢測(cè)氯霉素。

Abnous等[30]合成了一種三明治型比色傳感器用于定量測(cè)定血清和食品中的氯霉素?；陂g接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，用具有特定性質(zhì)的金納米粒子、生物素和鏈霉親和素合成三明治型比色傳感器。當(dāng)體系中不存在氯霉素時(shí)，傳感器顯示紅色；當(dāng)存在目標(biāo)化合物時(shí)，紅色褪去。該傳感器對(duì)氯霉素顯示出極高的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)451 pmol/L。

5 分子印跡法

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technique，MIT）是一種基于分子識(shí)別的分離技術(shù)，合成的分子印跡化合物對(duì)目標(biāo)分子具有特異性識(shí)別能力，能夠從復(fù)雜樣品中高選擇地識(shí)別出目標(biāo)化合物。因此在分析檢測(cè)領(lǐng)域備受關(guān)注。

張真麗等[31]利用沉淀聚合法制備了具有特異性識(shí)別能力的氯霉素分子印跡聚合物。吸附溫度為20 ℃，氯霉素的起始質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，分子印跡聚合物24 h吸附量達(dá)到172.35 μg/kg，氯霉素的起始質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)，分子印跡聚合物24 h吸附量達(dá)到321.85 μg/kg。

張麗君等[32]用電化學(xué)聚合的方法在Pt上合成了氯霉素分子印跡膜電極，通過(guò)掃描電子顯微鏡和電化學(xué)技術(shù)對(duì)聚合膜的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，該膜電極對(duì)氯霉素檢測(cè)有較好的選擇性和靈敏度，其線性范圍為4.33×10-8～3.09×10-6 mol/L，檢出限為2.5×10-8 mol/L。

6 生物芯片法

生物芯片是近年發(fā)展起來(lái)的熱門(mén)方法，具有快速、高通量等優(yōu)勢(shì)，其種類較多，是未來(lái)發(fā)展的主要趨勢(shì)之一。左鵬等[33]建立了蛋白芯片法檢測(cè)氯霉素的方法，檢測(cè)限可達(dá)到0.01 μg/L。張東等[34]采用微珠芯片免疫法定量測(cè)定了氯霉素的殘留量，檢出限也可達(dá)到0.01 μg/L。

7 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，氯霉素類藥物殘留的分析方法不斷增多。實(shí)驗(yàn)室主要采用GC-MS和HPLC-MS-MS法進(jìn)行檢測(cè)確證，GC-MS法需要衍生化，耗時(shí)較長(zhǎng)，HPLC-MS-MS法靈敏度高、檢測(cè)限低，但儀器昂貴，樣品前處理復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。未來(lái)發(fā)展主要以簡(jiǎn)化前處理過(guò)程為主。微生物法在實(shí)際中用于初篩表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，但易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。傳感器種類多、形式各異，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，是未來(lái)氯霉素藥物殘留檢測(cè)的發(fā)展方向；分子印跡技術(shù)具有良好的識(shí)別特性，也是將來(lái)發(fā)展的主要方向。

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