TNF—α在干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞的表達(dá)

張怡 蔣姝樂 杜爾罡

[摘要] 目的 探討TNF-α在干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞的表達(dá)。 方法 選擇2014年1月～2015年6月確診為干眼癥患者28例以及以眼干為主訴確診為非干眼癥的31例為研究對(duì)象。比較兩組BUT水平、基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)（Schirmers Test）結(jié)果，TNF-α定量PCR檢測(cè)結(jié)果，分析干眼癥患者TNF-α與BUT水平、Schirmers Test結(jié)果的相關(guān)性。 結(jié)果 干眼癥組患者BUT水平、Schirmers Test結(jié)果顯著低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干眼癥組患者TNF-α mRNA定量PCR檢測(cè)結(jié)果（1.55±0.26），對(duì)照組（0.99±0.18），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干眼癥患者TNF-α mRNA與BUT具有顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系（r=-0.691）。干眼癥患者TNF-α mRNA與Schirmers Test具有顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系（r=-0.917）。 結(jié)論 干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞TNF-αmRNA顯著升高，并且與BUT水平、Schirmers Test結(jié)果呈顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說明TNF-α參與了干眼癥的發(fā)生及發(fā)作，與患者病變嚴(yán)重程度具有密切相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] TNF-α；干眼癥；結(jié)膜細(xì)胞；基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)；淚膜

[中圖分類號(hào)] R777.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）08-0008-03

干眼癥最常見的病理表現(xiàn)是炎癥，淚液質(zhì)、量異常，淚液流體動(dòng)力學(xué)異常，淚膜穩(wěn)定性破壞。患者典型的癥狀包括眼部異物感、眼表易激惹狀態(tài)等。目前干眼癥的發(fā)生機(jī)制還不十分明確，目前認(rèn)為，內(nèi)分泌失調(diào)、高齡、自身免疫性疾病、角膜神經(jīng)異常、維生素缺乏、感染、藥物、隱形眼鏡等多種因素導(dǎo)致。炎癥在干眼癥的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用[1，2]。淚膜穩(wěn)定性遭到破壞，滲透壓增高，炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是重要的炎性因子，研究顯示患者淚液、結(jié)膜上皮細(xì)胞中TNF-α水平增加。本研究分析TNF-α在干眼癥患者結(jié)膜細(xì)胞的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2015年6月在我院以眼干為主訴診治的患者74例為研究對(duì)象。初步排除結(jié)石、倒睫、瞼緣炎、角結(jié)膜異物，眼燒傷等疾病，主訴為視疲勞、眼干、眼痛、微光、干澀、眼紅、燒灼感等。74例患者通過前期確診為干眼癥及非干眼癥患者中進(jìn)行篩選。干眼癥組：患者有視疲勞、眼干、眼痛等癥狀，BUT低于6 s，Schirmers Test 10mm/5min以下，眼部無手術(shù)史，無角膜接觸配鏡佩戴史。符合標(biāo)準(zhǔn)者共28例，其中男11例，女17例，年齡36～69歲，平均（51.8±10.6）歲。非干眼癥對(duì)照組：BUT超過10 s，Schirmers Test 10 mm/5 min以上，無角膜接觸配鏡佩戴史，無眼部手術(shù)史，無結(jié)膜炎。符合標(biāo)準(zhǔn)者共31例，其中男13例，女18例，年齡35～66歲，平均（50.9±10.3）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 相關(guān)檢查

1.2.1 淚膜破裂時(shí)間測(cè)定（BUT） 向患者結(jié)膜囊滴入2%熒光素鈉1滴，眨眼數(shù)次，使熒光素均勻涂布在角膜，裂隙燈下，采用鈷藍(lán)濾光片觀察、記錄最后一次眨眼，到出現(xiàn)第一個(gè)隨機(jī)分布的黑斑時(shí)間，10 s以下為正常。檢測(cè)結(jié)束后，采用0.25%氯霉素沖洗。

1.2.2 Schirmers Test 結(jié)膜囊內(nèi)滴入眼表面麻醉劑，取Schirmers Test濾紙條，在下眼瞼緣外2/3，輕閉眼睛，避免解除眼球，5 min后取出，記錄淚液浸濕長(zhǎng)度，記錄度數(shù)，10 mm以下為陽(yáng)性。

1.2.3 結(jié)膜印記細(xì)胞學(xué)檢查 表面麻醉劑進(jìn)行眼表麻醉，高壓滅菌的硝酸纖維膜圓形紙片，貼在距角膜緣2 mm上方球結(jié)膜表面，消毒玻棒輕輕加壓，然后撕下，投入TRIzol裂解液中，4℃保存待用。

1.2.4 TNF-α mRNA實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量 ①提取RNA。取泡有硝酸纖維膜TRIzol裂解液，加氯仿，靜止5 min，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心，15 min，取上清，加入EP管，加異丙醇，混勻，靜置5 min；4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心，10 min，加75%酒精清洗，4℃，7 500轉(zhuǎn)/min，離心5 min，晾干；用RNase-free水溶解RNA，-20℃保存。②將提取的RNA通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR：轉(zhuǎn)錄體系：逆轉(zhuǎn)錄模板2 μL，super mix 10 μL，primer 1 μL，H2O，定容至20 μL；步驟：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次，75℃延伸50 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BUT及Schirmers Test結(jié)果比較

見表1。干眼癥患者BUT水平、Schirmers Test結(jié)果顯著低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.2 兩組TNF-α mRNA定量PCR檢測(cè)結(jié)果

干眼癥組患者TNF-α mRNA定量PCR檢測(cè)結(jié)果（1.55±0.26），對(duì)照組（0.99±0.18）。兩組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.696，P<0.01）。見圖1。

2.3干眼癥患者TNF-α mRNA與Schirmers Test的相關(guān)性

見圖2。干眼癥患者TNF-α mRNA與Schirmers Test具有顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系（r=-0.917）。

2.4 干眼癥患者TNF-α mRNA與BUT的相關(guān)性

見圖3。干眼癥患者TNF-α mRNA與BUT具有顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系（r=-0.691）。

3討論

干眼癥又稱為干燥性角結(jié)膜炎，是多因素疾病，設(shè)計(jì)淚液及眼球標(biāo)本，患眼有畏光、異物感、瘙癢、視力波動(dòng)等癥狀。干眼癥隨著年齡的上升，患病率有顯著上升。輕度干眼癥患者主要是刺激癥狀，重度者可出現(xiàn)感染、角膜新生血管形成、角膜混濁、角膜潰瘍，甚至穿孔失明。干眼癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為，內(nèi)分泌失調(diào)、高齡、自身免疫性疾病、角膜神經(jīng)異常、維生素缺乏、感染、藥物、隱形眼鏡等多種因素導(dǎo)致。目前學(xué)界普遍認(rèn)為炎癥在干眼癥的發(fā)生及發(fā)展過程中能發(fā)揮重要的作用[3，4]。

人類的眼表系統(tǒng)包括結(jié)膜、角膜、淚腺、鼻淚管、瞼板腺，以及相關(guān)聯(lián)的結(jié)締組織。各個(gè)器官之間分布連續(xù)的上皮細(xì)胞，互相聯(lián)系的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫反應(yīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、血液循環(huán)等，共同調(diào)節(jié)淚腺分泌、淚膜的穩(wěn)定性。在這個(gè)調(diào)節(jié)過程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生損傷，均會(huì)導(dǎo)致破壞眼表微環(huán)境的平衡，破壞淚膜穩(wěn)定性，滲透壓失衡，眼表炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。干眼癥患者眼表皮上皮細(xì)胞暴露在高滲的淚液中，啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子，趨化因子等炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)激活iAPC，誘導(dǎo)其遷移至淋巴組織，在淋巴結(jié)內(nèi)吸引幼稚T細(xì)胞，促進(jìn)自身反應(yīng)性Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞等T細(xì)胞亞群增殖[5，6]。Th1細(xì)胞分泌TFN-γ，上調(diào)趨化因子、趨化因子受體、ICAMs，促進(jìn)IL-17的分泌，進(jìn)一步導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶、促炎細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致上皮損傷[7，8]。干眼癥患者炎性浸潤(rùn)、滲透壓增加、機(jī)械損傷等均會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子上調(diào)。有學(xué)者研究結(jié)果顯示，干眼癥患者結(jié)膜上皮細(xì)胞的TNF-α、IL-1、IL-6、TFGF-1等表達(dá)升高[9]。在本次研究中，我們采用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)結(jié)膜上皮細(xì)胞TNF-α mRNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示患者TNF-α mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，說明TNF-α參與了干眼癥的發(fā)生。

干眼癥眼表的炎癥狀態(tài)是持續(xù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果，角膜細(xì)胞CD4+T細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞激活、局部浸潤(rùn)。干燥因素導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子分泌，尤其是結(jié)膜組織IL-1、IL-6、TNF-α釋放。成熟的長(zhǎng)遠(yuǎn)呈遞細(xì)胞刺激幼稚T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌IL-17、TH1細(xì)胞分泌IFN-γ。IL-17釋反作用與Th17細(xì)胞，其通過TGF-β活性，拮抗調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，基質(zhì)金屬蛋白酶、炎性細(xì)胞因子分泌等導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷[10-12]。結(jié)膜部分上皮對(duì)外開放，上皮細(xì)胞內(nèi)有活躍的離子通道運(yùn)輸、耦合滲透作用，以負(fù)責(zé)鹽水交換，維持電解質(zhì)平衡，滲透壓正常，對(duì)維持眼表的濕潤(rùn)具有重要的作用。穹窿結(jié)膜、瞼結(jié)膜、球結(jié)膜、淚腺中的離子通道表達(dá)不同，除淚腺以外的眼表組織中，廣泛存在上皮鈉通道，而穹窿結(jié)膜內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)最為活躍。

TNF-α是一種重要的炎性細(xì)胞因子，是一種內(nèi)源性致熱源，主要由巨噬細(xì)胞分泌，具有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致發(fā)熱等作用，也會(huì)啟動(dòng)正常及異常的免疫應(yīng)答等細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，導(dǎo)致敗血癥，引起炎性細(xì)胞的募集、血管通透性改變、惡病體質(zhì)等[13]。有學(xué)者認(rèn)為，促炎因子抑制釋放神經(jīng)遞質(zhì)，如IL-6能夠抑制乙酰膽堿、肌間去甲腎上腺素的釋放。炎性細(xì)胞因子還能夠誘導(dǎo)包膜蛋白質(zhì)角化，參與角化性眼表疾病的病理變化[14，15]。TNF-α是炎癥強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，刺激產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子。

Schirmers Test、BUT是臨床上輔助診斷干眼癥的主要方法，但也有部分患者體征、癥狀不一致，這種情況下，能夠結(jié)合病程、炎癥標(biāo)志物來診斷，可使治療更有針對(duì)性。Schirmers Test反映了基礎(chǔ)淚液分泌情況[16，17]。本次研究中，干眼癥患者Schirmers Test結(jié)果顯著低于正常對(duì)照組，說明干眼癥患者淚液分泌減少，但TNF-α水平增加，進(jìn)一步分析TNF-α水平與Schirmers Test結(jié)果呈顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說明干眼癥患者TNF-α水平越高，淚液分泌越少，患者病情越重[18，19]，BUT反映了淚膜穩(wěn)定性[3]。在本次研究中，干眼癥患者BUT結(jié)果顯著低于對(duì)照組，說明干眼癥患者淚膜穩(wěn)定性較差。進(jìn)一步分析，患者TNF-α水平越高，淚膜穩(wěn)定性越低，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說明干眼癥患者TNF-α水平越高，病情越重。

綜上所述，干眼癥患者TNF-α表達(dá)顯著升高，并且與患者Schirmers Test、BUT結(jié)果具有負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說明TNF-α參與了干眼癥的發(fā)生及發(fā)作過程，與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[20]。

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（收稿日期：2015-12-14）