氰尿酸誘導孕鼠形成腎結石動物模型的研究

劉迪 吳希慶 薩音白剛 楊建新

1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古包頭 014000；2.內蒙古包鋼第三職工醫(yī)院，內蒙古包頭 014000

[摘要] 目的 研究氰尿酸在孕鼠妊娠期內能否形成腎臟結石，探討氰尿酸對孕鼠生育的影響。 方法 將氰尿酸劑量按50、100、250、400、550、700 mg/（kg×d）灌胃孕鼠，對照組灌入蒸餾水，孕鼠生產(chǎn)后停止灌胃。觀察孕鼠的產(chǎn)仔情況，HE染色觀察孕鼠的腎臟組織的病理變化。結果 400、700 mg/（kg×d）組孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量明顯低于對照組（P< 0.05）。250、400、550、700 mg/（kg×d）組分別有2、4、5、4只孕鼠在病理切片中可見腎小管、集合管有結石樣物質。 結論 妊娠期孕鼠灌胃氰尿酸后，高劑量實驗組孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量受到明顯抑制；在病理切片中發(fā)現(xiàn)結石樣物質，并隨著劑量的上升加快成石，成功得到了氰尿酸孕鼠腎結石的模型。

[關鍵詞] 氰尿酸；腎結石；孕鼠模型

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）03（b）-0039-04

Study on the Pregnant Rat Model with Kidney Stones Induced by Cyanuric Acid

LIU Di1， WU Xi-qing2， SAYIN Bai-gang2， YANG Jian-xin2

1.Inner Mongolia University of Science and Technology Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China； 2.Department of Urinary Surgery， the Third Staff Hospital of Baogang Group， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China

[Abstract] Objective To investigate whether cyanuric acid can cause the formation of kidney stones in pregnant rats and explore the effect of cyanuric acid on the fertility in pregnant rats. Methods The pregnant rats in cyanuric acid gavage group were given intragastric administration of cyanuric acid 50， 100， 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d）， respectively， and those in the control group were given intragastric administration of distilled water. The lavage was stopped after production. The litter situation， pathological changes in the kidney tissue by HE staining in the rats were observed. Results The number of litter in the 400， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group was obviously less than that in the control group， respectively （P<0.05）. Pathological section showed that there were 2， 4， 5， 4 pregnant rats with material like stones in the renal tubule and collecting duct respectively in the 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group. Conclusion The litter amount in the pregnant rats group with intragastric administration of large-dose cyanuric acid was significantly reduced. Stone-like material was found in the pathological section， and it fast formed the stone with the increase of the dose of cyanuric acid， so the pregnant rat model with kidney stones induced by cyanuric acid was obtained successfully.

[Key words] Cyanuric acid； Kidney stone； Pregnant rat model

氰尿酸，又名三聚氰酸，是一種在工業(yè)上常見的化學物質，其結構與三聚氰胺相似，同時也是生產(chǎn)三聚氰胺過程中必不可少的化工原料，其主要廣泛應用于消毒業(yè)，并被用來進行游泳池的消毒[1]，但是在2007年韓國及美國寵物食用飼料死亡事件以及我國三鹿牌奶粉事件相繼曝光后，三聚氰胺及其結構類似物氰尿酸出現(xiàn)在人們的視野里，在奶粉及動物飼料里添加這類物質目的是提高蛋白質的檢測含量，目前國外已有動物實驗證明三聚氰胺與氰尿酸聯(lián)合灌胃老鼠與單獨灌服三聚氰胺相比，前者對腎功能的毒性更強，形成泌尿系結石更快[2]。因此，在對三聚氰胺進行深入研究的同時，氰尿酸大鼠尿路結石模型的研究非常有必要，而孕鼠尿路結石模型的研究在預防和治療氰尿酸尿路結石上更有價值。為探討氰尿酸對孕鼠生育的影響，該實驗于2015年9月開始，同年10月結束，實驗動物樣本總數(shù)84只。

1 試驗材料

1.1 研究對象、藥物及器材

SPF級Wistar雄性大鼠28只，90日齡；SPF級Wistar雌性大鼠56只，體重（250±20）g，90日齡。大鼠精神狀態(tài)良好，實驗室溫度、濕度恒定，12 h明、暗交替，動物可隨意獲取水及食物，所有實驗及護理過程遵循我國制定的實驗動物管理條例的指導，并嚴格遵守動物保護公約及禁止虐待動物公約。大鼠及鼠糧均由北京維通利華動物實驗有限公司提供（合格證號：SCXK（京）2012-0001）。氰尿酸（化學純，含量>98.0%），分子式為C3H3N3O3。生物顯微鏡：Olympus，日本。

1.2 實驗分組

將56只Wistar雌鼠隨機分為7組（G0-G6）每組8只，對照組為G0，實驗組為G1-G6 ，28只雄鼠隨機均分7組，按照雄鼠和雌鼠1：2的比例，將各組的雌鼠和雄鼠隨機合籠，每籠雄鼠4只，雌鼠8只，早晚檢查陰道栓（為雄鼠精液與雌鼠分泌物混合后風干形成）確定受孕情況。

1.3 造模方法

隨機將雌鼠分成G0-G6共7組，每組8只。氰尿酸灌胃組（G1-G6）按劑量50、100、250、400、550、700 mg/（kg·d）灌胃孕鼠，對照組G0灌入蒸餾水，均按每只1 mL/100 g灌胃，孕鼠生產(chǎn)后停止灌胃。氰尿酸的灌胃劑量根據(jù)Hodge等給予大鼠灌胃三聚氰酸鈉的劑量為參考[3]。對照組及氰尿酸灌胃組的雌鼠在確定妊娠后，按照實驗分組分別單獨喂養(yǎng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 孕鼠的一般情況及正常產(chǎn)期產(chǎn)下的仔鼠數(shù)量 在開始灌胃后，在保證鼠糧及飲用水充足的情況下每天觀察妊娠孕鼠的飲食及飲水量，觀察孕鼠白天和夜晚的精神狀態(tài)；并將正常產(chǎn)期內各組孕鼠產(chǎn)下的仔鼠數(shù)量做記錄，將各組孕鼠生產(chǎn)出的仔鼠的數(shù)值求和后取平均數(shù)，再進行比較。

1.4.2 孕鼠腎臟病理變化 孕鼠分娩后乙醚麻醉處死雌鼠，并且在無菌條件下切取腎臟觀察，將雙腎做成病理切片，在顯微鏡下對腎臟進行觀察。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理時應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用t檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗。

2 實驗結果與分析

2.1 妊娠雌鼠的一般情況

實驗組Wistar 孕鼠與對照組比較，未出現(xiàn)脫毛、毛發(fā)直立以及毛發(fā)稀松等現(xiàn)象。G4、G5、G6組與對照組比較表現(xiàn)出了不愿進食、活動少，對周圍環(huán)境敏感，容易受到驚嚇，飲水量增多、尿量增加。

2.2 新生仔鼠的總數(shù)及平均數(shù)

在成功受孕并存活的52只孕鼠當中，共有47只孕鼠順利分娩產(chǎn)下仔鼠，各組孕鼠分娩出的仔鼠的數(shù)量的總和及平均數(shù)見表1，如表所示，在所有實驗組中，只有M4、M6組的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠數(shù)量與對照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05） ；其余各組的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。

2.3 妊娠雌鼠腎臟病理檢測結果

對照組妊娠孕鼠腎臟的外觀及大小正常，包膜光滑完整，顏色鮮紅，在切開腎臟后未見到腎皮質和腎髓質有明顯異常。腎臟的腎乳頭、腎盞、腎盂等腎臟解剖結構正常，病理切片示無明顯異常，見圖1。各組孕鼠發(fā)生腎結石的情況見表2，M3-M6組孕鼠在腎小管內發(fā)現(xiàn)結石樣物質，這些結石樣物質沉積在集合管和腎小管中，見圖2，部分孕鼠腎臟在皮、髓質交界處偶可見到點、片狀出血灶，同時可見上皮細胞腫脹伴有損傷和脫落，腎實質與對照組相比萎縮明顯，同時也可見到部分腎小球萎縮，但未見明顯的腎間質纖維化等病理表現(xiàn)。

3 討論

繼2004及2007年寵物死亡事件中飼料檢測出三聚氰胺后，作為一種新物質——氰尿酸浮出水面，研究發(fā)現(xiàn)氰尿酸與三聚氰胺同時添加時，其成石率及腎毒性遠遠大于單獨添加其中一種物質[4]。Hodge等人的研究[3]，通過分別給予大鼠、B6C3F1小鼠高劑量三聚氰酸鈉 500～700 mg/kg、2 000～2 200 mg/kg經(jīng)口灌胃，3個月后在兩種鼠的膀胱里找到了結石同時伴有膀胱的上皮細胞增生。Ji等將混合后的三聚氰胺+氰尿酸（63/6.3 mg/kg）經(jīng)口灌胃實驗動物后，發(fā)現(xiàn)混合物對腎臟等泌尿系器官的損害遠遠大于這兩種物質的單獨作用，并于腎臟內發(fā)現(xiàn)結晶樣物質[4]；而Stine在給妊娠孕鼠攝入三聚氰胺及氰尿酸后，于孕鼠的羊水中檢測到三聚氰胺及氰尿酸，證實了三聚氰胺及氰尿酸能夠從動物的母體轉移到胎兒，對妊娠期的胎兒產(chǎn)生毒性作用，導致胎兒流產(chǎn)、死胎等[5]。

Chen通過給予大鼠灌胃三聚氰胺氰尿酸鹽（1：1）400 mg/kg，12 h后發(fā)現(xiàn)近端小管開始變性壞死，48 h后發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟遠端小管擴張并可見少量的黃綠色結晶，推斷早期腎功能衰竭可能與三聚氰胺氰尿酸鹽堵塞腎小管有關[6]。Bob的研究團隊發(fā)現(xiàn)腸道中某些種類的克雷伯氏菌例如K.Terrigena可將三聚氰胺分解成氰尿酸，生成的氰尿酸與三聚氰胺相遇后加重了腎臟的損害，并加快了結石的形成[7]，這說明了氰尿酸在成石過程中扮演著重要的角色。Yin等人的研究還發(fā)現(xiàn)三聚氰胺及其結構類似物對小鼠脾臟淋巴細胞有一定的毒性作用[8]。

該研究通過給妊娠孕鼠灌胃劑量分別為50～700 mg/（kg×d）的氰尿酸后建立了模型組。在實驗研究的過程中，能夠發(fā)現(xiàn)高劑量組的孕鼠生長較對照組雌鼠發(fā)育緩慢，精神狀態(tài)差，不愿活動，在灌胃的第9天和第11天氰尿酸灌胃組雌鼠死亡3 只，通過對雌鼠的尸體進行解剖后研究發(fā)現(xiàn)，雌鼠的胸腔未見積血，未見食管受損或破裂，腎臟內可見充血，打開胃后可見白色粉狀食糜，雙子宮內可見未發(fā)育完全的仔鼠，這說明高濃度氰尿酸的攝入可能限制了妊娠雌鼠的正?；顒?，抑制了仔鼠的發(fā)育，另一項實驗數(shù)據(jù)同樣提示與對照組的孕鼠相比，高劑量氰尿酸灌胃組孕鼠分娩出的仔鼠數(shù)量明顯少于對照組，同時在400 mg/kg、550 mg/kg以及700 mg/kg組的病理切片中發(fā)現(xiàn)了結石樣結晶，但在700 mg/kg組中的病理切片結石樣結晶更加顯著，原因可能是被攝入的氰尿酸劑量增加導致通過腎臟排泄的氰尿酸濃度上升，相比較低劑量的組更容易形成結石。另一方面高劑量組與低劑量組相比尿量減少同樣也間接提高了結晶的濃度。高劑量氰尿酸攝入動物體內在尿液中出現(xiàn)的結晶需要經(jīng)腎臟的腎小管排泄，當結晶的量達到一定程度時腎小管的負荷加大，最終可能因為結晶沉積堵塞腎小管甚至損傷腎單位，但攝入氰尿酸后在體內形成的晶體是否對腎單位有毒性，目前還不能肯定。

綜上所述，通過該實驗得出的結果說明氰尿酸作為三聚氰胺的類似物，對人類的確有一定的危害，需要我們繼續(xù)對其研究，目前對于三聚氰胺、氰尿酸的成石機制還未完全清楚，該實驗通過給妊娠雌鼠灌胃攝入氰尿酸的方法，成功建立了氰尿酸孕鼠尿路結石的模型，為氰尿酸尿路結石合并妊娠的預防和治療提供實驗依據(jù)。并且應用氰尿酸建立孕鼠尿路結石動物模型尚屬首創(chuàng)，類似動物模型國內外研究較少，通過觀察孕鼠的生長及生產(chǎn)情況，對預測氰尿酸對妊娠婦女的影響也同樣具有重大意義。

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[7] Bob Weinhold.Gut bacteria and melamine toxicity[J].Environ Health Perspect，2013，121（5）：149.

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（收稿日期：2015-12-07）