HE4在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)

任俊英 李銀鳳 王維琴 皇甫昱

[摘要] 目的 通過檢測(cè)HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、異位子宮內(nèi)膜、正常內(nèi)膜中的表達(dá)，把HE4作為一個(gè)腫瘤標(biāo)記物，來鑒別盆腔腫物性質(zhì)提供診斷依據(jù)。 方法 整群選取內(nèi)蒙古人民醫(yī)院2012年7月—2014年7月收治的167例手術(shù)患者，通過病理確診：其中子宮內(nèi)膜異位癥的60例，卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本30例，正常內(nèi)膜組織的因子宮病變而進(jìn)行子宮全切術(shù)的患者30例，上皮性卵巢癌47例。采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各組石蠟切片進(jìn)行化學(xué)染色，并進(jìn)行對(duì)各組標(biāo)本染色結(jié)果的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)應(yīng)用mIgae-or-plus對(duì)染色切片中的陽性部分測(cè)量其平均灰度值（meanIOD），并分析HE4在各組中的表達(dá)情況。結(jié)果 子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢上皮性惡性腫瘤、正常內(nèi)膜中均有HE4的表達(dá)，HE4在卵巢良性腫瘤中的表達(dá)呈弱陽性或者陰性表達(dá)。HE4的表達(dá)在卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜、卵巢良性腫瘤中表達(dá)呈逐級(jí)下降趨勢(shì)，HE4在四種不同組織中的表達(dá)的mean IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且進(jìn)行兩兩組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ①HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、正常內(nèi)膜、卵巢良性腫瘤中的表達(dá)呈現(xiàn)逐級(jí)下降趨勢(shì)，通過探索性研究，HE4可能作為一個(gè)良好的卵巢腫瘤標(biāo)記物，有助于來鑒別盆腔腫物性質(zhì)提供診斷依據(jù)；也表明HE4對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等發(fā)揮著重要作用。

[關(guān)鍵詞] HE4；卵巢腫瘤；子宮內(nèi)膜異位癥；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）03（b）-0015-04

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4， a tumor marker， in patients with malignant epithelial ovarian cancer， benign ovarian tumor， endometriosis and normal endometrium so as to provide a diagnostic base for the identification of pelvic tumor. Methods In this study， 167 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， the benign ovarian tumor tissue samples from 30 cases and normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control respectively， and 47 samples of epithelial ovarian cancer as the positive control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. The expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 were determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the groups was analyzed. Results Endometriosis， malignant epithelial ovarian tumor and normal endometrium had the distinct expression of HE4. The expression of HE4 was weakly positive or negative in benign ovarian tumor. The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor， and the mean IOD value of HE4 expression in the four different tissues had significant difference （P<0.05）， and pairwise comparisons were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression of HE4 showed a step-down trend in the malignant epithelial ovarian tumor， endometriosis， normal endometrium and benign ovarian tumor. The study indicated that HE4 may be a good epithelial ovarian tumor marker， which provides diagnostic basis for identifying the nature of pelvic tumor； and plays an important role in the oncogenesis， invasion， metastasis， and outcome of the tumor.

[Key words卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，5年生存率有早期的80%下降為晚期的15%[1]。目前，對(duì)于早期診斷卵巢癌其敏感性和準(zhǔn)確性均欠佳。因此對(duì)2012年7月—2014年7月就診于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院患者，根據(jù)術(shù)后病理確診為卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、異位子宮內(nèi)膜、正常內(nèi)膜進(jìn)行免疫組化檢測(cè)HE4的表達(dá)結(jié)果，有望把HE4作為一個(gè)腫瘤標(biāo)記物[2]，來鑒別盆腔腫物性質(zhì)提供診斷依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選擇內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院2012年7月—2014年7月收治的手術(shù)病例167例，通過病理確診的卵巢腫瘤手術(shù)患者石蠟標(biāo)本，其中上皮性卵巢癌47例年齡35～82歲，平均年齡45.5歲，卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本30例年齡16～67歲，平均年齡34.4歲，子宮內(nèi)膜異位癥的60例年齡31～52歲，平均年齡35歲，正常內(nèi)膜組織的因子宮病變而進(jìn)行子宮全切術(shù)的患者30例年齡41～56歲，平均年齡49歲。實(shí)驗(yàn)組：異位內(nèi)膜組織蠟塊60例。陰性對(duì)照組：卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本30例正常對(duì)照組：正常內(nèi)膜組織標(biāo)本30例；陽性對(duì)照組：卵巢上皮性惡性腫瘤組織標(biāo)本47例。4組樣本之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 試劑及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，規(guī)格100 ug濃縮液。批號(hào)14406-1AP；保存開封后4℃保存。二抗：即用型SABC免疫組化染色試劑盒，規(guī)格：12 mL 4℃保存，避免冷凍，DAB試劑盒：以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

免疫組化染色：標(biāo)本石蠟塊，制作成4 μm石蠟切片，烤片，脫蠟，水化，滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉液滴加于每張切片，每張切片滴加第一抗體兔抗人多克隆抗體HE4，4℃冰箱過夜，PBS液洗片，每張切片加試劑山羊抗兔IgG，20～37℃溫箱下卵育20 min，PBS沖洗，每張切片滴加SABC，室溫下孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，封片，然后在顯微鏡下閱片并照相。

觀察標(biāo)準(zhǔn)：病理科由2名醫(yī)生用雙盲法分別進(jìn)行閱片監(jiān)測(cè)。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率分布按照SHIMIZU等方法確定HE4在組織中的表達(dá)水平。①染色強(qiáng)度，染色不清楚（和）或無染色為0分；染色強(qiáng)于陰性顯示為弱黃色為1分；染色清晰棕黃色為2分；染色強(qiáng)為深棕色（和）或褐色為3分。②陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分；11%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。每張切片計(jì)分等于以上二項(xiàng)分?jǐn)?shù)的乘積；0～1分為（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；﹥5分為強(qiáng)陽性（+++）。

mIgae-or-plus5.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)下，測(cè)量每張切片的陽性細(xì)胞的平均灰度值（mean IOD）并將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)；多個(gè)樣本均數(shù)比較，經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間兩兩比較采用行×列資料分割的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE4在子宮異位內(nèi)膜、卵巢上皮性惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤、正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

根據(jù)測(cè)得的平均灰度值分析HE4在四個(gè)組間的表達(dá)情況：卵巢上皮性惡性腫瘤組織中HE4顆粒定位于組織中的細(xì)胞漿里，呈棕褐色腔緣陽性顆粒，其表達(dá)的mean IOD值為（0.4982±0.0284）。異位內(nèi)膜組織中HE4顆粒定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞膜及細(xì)胞漿中呈棕黃色陽性顆粒部分間質(zhì)可見陽性表達(dá)，其表達(dá)的mean IOD值為（0.5801±0.0115）。正常內(nèi)膜組織中HE4顆粒定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞膜及細(xì)胞漿中呈淡黃色弱陽性顆粒，部分間質(zhì)可見弱陽性表達(dá)，其表達(dá)的mean IOD值為（0.6801±0.0105）。卵巢良性腫瘤組織中HE4顆粒定位于組織中的細(xì)胞漿里，呈淡黃色弱陽性顆粒或陰性表達(dá)，其表達(dá)的meanIOD值為（0.7582±0.0172）。

將上述4組HE4表達(dá)的meanIOD值比較，（F檢驗(yàn)）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.162，P<0.05）（見表1）。4組資料兩兩比較，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

注：子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢上皮性癌兩組間比較，t=77.894，P=0.000；子宮內(nèi)膜異位癥與正常內(nèi)膜兩組間比較，t=59.346，P=0.000；子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢良性腫瘤兩組間比較，t=59.345，P=0.000。

2.2 HE4在4組不同組織中陽性表達(dá)的頻數(shù)分布進(jìn)行比較

HE4在卵巢上皮性惡性腫瘤中表達(dá)主要為強(qiáng)陽性過表達(dá)，而卵巢異位內(nèi)膜組織中為陽性表達(dá)，正常內(nèi)膜組織中為弱陽性表達(dá)，卵巢良性腫瘤組織多數(shù)為陰性表達(dá)。經(jīng)行×列資料分割的χ2檢驗(yàn)對(duì)4種組織中HE4的頻數(shù)分布比較：卵巢上皮性惡性腫瘤組織中HE4的頻數(shù)分布與其他3組的頻數(shù)分布均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）：卵巢異位內(nèi)膜組織HE4的頻數(shù)分布與正常內(nèi)膜組織、卵巢良性腫瘤組織的頻數(shù)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；正常內(nèi)膜組織與卵巢良性腫瘤組織的頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.800，P=0.371﹥0.05）。見表2。

注：四組資料兩兩比較，除正常內(nèi)膜組與卵巢良性腫瘤組相比，χ2=0.800，P=0.371>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間比較P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

HE4 屬于抑蛋白酶基因家族，定位于染色體20q12 -13. 1，編碼一種與精子成熟相關(guān)的小分子分泌蛋白[3] 。HE4cDNA 最早是由Kirchhoff 等于1991 年從人的附睪上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其主要分布于包括附睪在內(nèi)的生殖系統(tǒng)上皮，如輸精管上皮、輸卵管上皮和子宮內(nèi)膜等組織[4]。研究顯示，HE4 在多種惡性腫瘤，如漿液性卵巢癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌等組織中高表達(dá)。大量研究表明，HE4 在識(shí)別卵巢癌的早期階段具有很高的靈敏度和特異度。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：HE4在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥、正常內(nèi)膜、卵巢良性腫瘤中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），其中HE4在卵巢漿液性囊腺癌中逞強(qiáng)陽性表達(dá)，在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)呈中度陽性表達(dá)而正常內(nèi)膜、卵巢良性腫瘤中的表達(dá)呈弱陽性或陰性表達(dá)。大量研究表明，HE4 在識(shí)別卵巢癌的早期階段具有很高的靈敏度和特異度，因此國(guó)外許多國(guó)家已將HE4 作為卵巢癌早期篩查的最佳指標(biāo)。 陳穎等[5]發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA 表達(dá)在卵巢癌發(fā)生中作為早期分子事件發(fā)揮重要作用，通過研究卵巢交界性腫瘤、早期卵巢癌和卵巢癌組中HE4mRNA陽性表達(dá)率分別為81.0%、85.4%和88.2%， 發(fā)現(xiàn)HE4 mRNA 表達(dá)上調(diào)參與了卵巢癌發(fā)生和侵襲。HE4作為一個(gè)良好的卵巢腫瘤性標(biāo)記物，有助于鑒別盆腔腫物性質(zhì)提供依據(jù)，并且可檢測(cè)卵巢惡性腫瘤的預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)[6-8]這也表明HE4對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等發(fā)揮著重要作用。

綜上所述通過對(duì)HE4不同檢測(cè)值范圍的比較，有望制定一個(gè)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)范圍，以便可以診斷卵巢上皮癌與子宮內(nèi)膜異位癥，進(jìn)一步對(duì)卵巢上皮性癌、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔良性包塊的鑒別作為一個(gè)重要依據(jù)[9]。HE4對(duì)于卵巢上皮性惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥均有很好的輔助診斷價(jià)值。但對(duì)于疾病的早期診斷，如果還能同時(shí)結(jié)合超聲及婦科檢查可進(jìn)一步提高其診斷的特異性和準(zhǔn)確性。HE4在子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)病可能有相似的病理學(xué)基礎(chǔ)，且HE4很可能在該類疾病中的某個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮一定的作用。有待于進(jìn)一步研究，制定一個(gè)醫(yī)學(xué)參考值范圍，把HE4作為一個(gè)很好的卵巢腫瘤標(biāo)記物對(duì)盆腔腫物的性質(zhì)做出鑒別診斷[10]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[2] Rafael Molina， Jose M. Escudero， Jose M. Augé， et al. HE4 a novel tumour marker for ovarian cancer： comparison with CA 125 and ROMA algorithm in patients with gynaecological diseases[J]. Tumour Biol，2011， 32（6）： 1087-1095.

[3] Galgano MT， Hampton GM， Frierson HF Jr. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues [J]. Modern Pathology， 2006， 19（6）： 847-853.

[4] Drapkin R， Lin Y， Mok SC， et al .Human epididymis protein 4（HE4） is a secreted glycoprotein that is over ex-pressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas[J].Cancer Res， 2005，65（6）：2162-2169.

[5] 陳穎，張巖，蔣宏頡.HE4 mRNA 在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義的研究[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2010，10（23）：5548-5551.

[6] Partheen K， Kristjansdottir B， Sundfeldt K. Evaluation of ovarian cancer biomarkers HE4 and CA-125 in women presenting with a suspicious cystic ovarian mass[J]. J Gynecol Oncol，2011，22（4）：244-252.

[7] Bolstad N， ijordsbakken M， Nustad K， et al. Human epididymis protein 4 reference limits and natural variation in a Nordic reference population[J].Tumour Biol，2012，33（1）：141-148.

[8] Chen WT，Gao X，Han XD，et al.HE4 as a serum biomarker for ROMA prediction and prognosis of epithelial ovarian cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（1）：101-105.

[9] Gislefoss RE ， Langseth H ， Bolstad N ， et al.HE4 as an Early Detection Biomarker of Epithelial Ovarian Cancer： Investigations in Prediagnostic Specimens From the Janus Serumbank[J].Int J Gynecol Cancer，2015，25（9）：1608-1615.

[10] Wilailak S，Chan KK，Chen CA，et al.Distinguishing benign from malignant pelvic mass utilizing an algorithm with HE4， menopausal status， and ultrasound findings[J].J Gynecol Oncol，2015，26（1）：46-53.

（收稿日期：2015-12-15）] HE4； Ovarian tumor； Endometriosis； Immunohistochemistry