萘乙酸對橡膠樹膠胞炭疽菌生長速率、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響

鄭肖蘭　胡飛　梁艷瓊　吳偉懷　鄭金龍習金根　李銳　賀春萍　易克賢

摘 要 橡膠樹炭疽病是影響橡膠樹割膠生產(chǎn)的重要病害之一，主要由膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌侵染引起的，在世界各大植膠地區(qū)引起了無數(shù)橡膠樹葉片脫落，甚至整株死亡，給當?shù)氐南鹉z產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴重損失。本實驗主要采用菌落生長速率法、孢子萌發(fā)測試法等常規(guī)植物病理學方法研究萘乙酸對橡膠樹膠胞炭疽菌RC169生長速率、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響。結果表明，低濃度時萘乙酸對RC169菌絲生長、孢子的萌發(fā)和附著胞的形成具有促進作用，但隨著用藥濃度的升高，其促進作用變?yōu)橐种谱饔茫乙种谱饔秒S之規(guī)律性增強。

關鍵詞 萘乙酸 ；橡膠樹膠胞炭疽菌 ；抑菌率 ；孢子萌發(fā)率 ；附著胞形成率

中圖分類號 S682.19；S794.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.010

Abstract The anthracnose is one of the most important diseases that affect the production of rubber tree. The anthracnose is caused by the infection of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum， which makes rubber leaves fall from trees， and causes serious losses of local rubber industry. This experiment was to explore the effect of NAA on C. gloeosporioides RC169's mycelial growth， spore germination and appressorium formation. The results showed that when NAA has low concentrations， it has promotion effect on the mycelial growth， spore germination and appressorium formation of RC169. With the NAA concentration increasing， the inhibition effect on mycelial growth spore germination and appressorium formation is strengthened.

Keywords NAA ； Colletotrichum gloeosporioides ； mycelial growth rate ； spore germination rate ； appressorium formation rate

橡膠樹炭疽病是影響橡膠樹割膠生產(chǎn)的重要病害之一。橡膠樹炭疽病主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）侵染引起，可導致世界各大植膠地區(qū)無數(shù)橡膠樹葉片脫落，甚至整株死亡，給當?shù)氐南鹉z產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴重損失[1]。橡膠樹炭疽病一直以來是制約橡膠產(chǎn)量的重要因素之一，其病原菌主要侵染橡膠樹葉片的幼嫩部位，導致橡膠樹葉片組織壞死或大量脫落，嚴重時造成大量落葉和嫩梢回枯，樹體衰弱，縮短割膠期限，推遲開割時間，導致橡膠總產(chǎn)下降。自1906年斯里蘭卡Peteh首次報道以來，已有十幾個植膠國家先后報道有此病發(fā)生。中國1962年在海南國營大豐農(nóng)場苗圃首次發(fā)現(xiàn)，隨著種植感病品系的增加，各植膠區(qū)陸續(xù)有其發(fā)生危害情況報道[2-3]。

萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）是一種用途較廣的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以提高種子中過氧化物酶和過氧化氫酶的完整性，對植物有促進發(fā)芽、生根、加速生長、提早成熟、增加產(chǎn)量等作用[4-5]。若能明確萘乙酸對橡膠樹膠胞炭疽菌生長速率、孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響，就可以深入研究其作用和影響的機理，從而對植物生長調(diào)節(jié)劑進行創(chuàng)新性改進，最后可望在利用萘乙酸調(diào)節(jié)橡膠樹幼苗和老樹生長的同時，對橡膠樹炭疽病進行同步防治。這樣既可以在橡膠樹苗期和出新芽期等時期利用萘乙酸調(diào)節(jié)其生長，并防治橡膠樹炭疽病，可望節(jié)省大量栽培和防治成本。

本實驗主要研究萘乙酸對橡膠樹膠胞炭疽菌RC169生長速率及其孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響，以期為今后使用萘乙酸防治橡膠樹炭疽病研究作好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

橡膠樹膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.1.2 試劑

2.5%萘乙酸微乳液由安林生物化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 萘乙酸對生長速率的影響

PDA培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯煮出液，10 g/L葡萄糖，18 g/L瓊脂，121℃滅菌20 min。

萘乙酸含藥培養(yǎng)基配制方法： ①計算好所需配置的藥量，取標準用藥量為中間值，向兩邊各取2個濃度梯度。②向25 mL容量瓶中加入藥劑后，再加入2.5 mL DMF溶劑（分析純，N，N-二甲基甲酰胺），加入適量（一般2滴）的助劑（消泡劑DX-10），然后定容至25 mL。③用系列濃度稀釋法將藥劑配出5個濃度梯度。④選擇96 mL的培養(yǎng)基熔化，待溫度適宜后分別向各培養(yǎng)基中加入4 mL不同濃度梯度的藥劑，混合均勻并倒入培養(yǎng)皿制成含藥培養(yǎng)基平板。⑤在各平板上接種供試菌株，并設置對照組。4～5 d后觀察，測量，記錄數(shù)據(jù)并拍照，根據(jù)以下公式計算出抑菌率：抑菌率（%）=（Φ1-Φ2）/（Φ1-D）。其中，D為打孔器的直徑，本實驗中D=0.5 cm；Φ1為對照組菌落直徑平均值；Φ2為實驗組菌落直徑平均值。

1.2.2 萘乙酸對孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響

根據(jù)預實驗得出：RC169產(chǎn)孢快且量大，萌發(fā)條件易控制。孢子萌發(fā)判定方法：當芽管長度大于孢子自身寬度的1/2時，即視為萌發(fā)。

實驗步驟：①水瓊脂玻片制備，將1%或2%水瓊脂熔化后，滴一滴水瓊脂至載玻片上，然后迅速用涂布棒推平，等其晾干。②孢子懸浮液的制取，直接向已產(chǎn)孢的培養(yǎng)皿中加入4～5 mL無菌水，將孢子洗脫下來，然后用參試試劑將其配制成每個視野中40～50個孢子的孢子懸浮液。③將制備好的孢子懸浮液滴一滴于①中的載玻片上，將載玻片放入含有濕潤濾紙的大培養(yǎng)皿中，置于28℃，濕度為90%恒溫培養(yǎng)箱中。待孢子在T h（無菌水中萌發(fā)率超過80%所需要的時間）時，先用棉蘭乳酚油固定，然后用計數(shù)器數(shù)出孢子總數(shù)，萌發(fā)數(shù)及附著胞形成數(shù)目，算出孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。④根據(jù)以上方法先進行預實驗，得出RC169的T h。然后根據(jù)得出的T h進行實驗，計算孢子萌發(fā)率[6]。

2 結果與分析

2.1 萘乙酸對生長速率的影響

萘乙酸對RC169生長速率影響結果見圖1。從圖1可看出，隨著萘乙酸參試濃度從0.4到64 μg/mL規(guī)律性增大，RC169對應的抑菌率則呈現(xiàn)規(guī)律性增加，分別為0.0、2.1%、0.6%、11.7%、14.7%、34.6%。總體上，隨著萘乙酸濃度的升高，RC169各菌落直徑隨之變小。通過處理原始數(shù)據(jù)，計算得出表1的結果。從表1處理得出相關的回歸方程y=0.542 2x-0.588 6，R2=0.968，差異達到極顯著，具體如圖2。實驗結果表明：植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸在一定的濃度范圍內(nèi)對橡膠樹炭疽菌RC169的生長速率有一定的抑制作用。

2.2 萘乙酸對孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響

萘乙酸對RC169孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響結果見表2。經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)，RC169孢子萌發(fā)率超過80%以上的T=12 h。由表2可知，隨著萘乙酸濃度從0.00、0.04到10.20 μg/mL，RC169 的平均孢子萌發(fā)率分別為80.2%、90.6%、83.7%、56.7%、53.3%、31.3%；平均附著胞形成率則為 68.8%、85.3%、54.5%、22.5%、19.7%、2.7%；表明在萘乙酸0.04 μg/mL濃度下，RC169 的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率均比對照稍大，但在總體上隨著萘乙酸濃度的升高，橡膠樹炭疽菌RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率隨之降低，差異顯著。為了更直觀地分析結果，依據(jù)數(shù)據(jù)求其相應的線性回歸方程，得出圖3和圖4。

由圖3可推出，孢子萌發(fā)率的回歸方程：

y=-10.954x+104.31，R2=0.816 5；孢子萌發(fā)結果差異達到極顯著。

附著胞形成率的回歸方程：

y=-15.978x+98.178，R2=0.864 3；附著胞形成結果差異達到極顯著。

總體而言，隨著萘乙酸濃度的升高，橡膠樹炭疽菌RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率隨之降低。但在0.04 μg/mL時的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率都比對照組大；從而推斷，在極低濃度下，萘乙酸對RC169孢子的萌發(fā)和附著胞的形成有一定的促進作用。

3 討論

本實驗表明：在一定濃度范圍內(nèi)2.5%萘乙酸微乳液，對橡膠樹膠胞炭疽菌RC169的生長速率具有抑制作用，且隨著用藥濃度的升高，其抑制作用相應增強。此外，在一定極低濃度范圍內(nèi)2.5%萘乙酸微乳液，對橡膠樹膠胞炭疽菌RC169孢子萌發(fā)和附著胞的形成也具有促進作用；隨著用藥濃度的增加，其對RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率由促進作用變?yōu)橐种谱饔?。由此可以推測，一定條件下，極低濃度的萘乙酸可以增強炭疽菌RC169的抗逆性能力，從而增強孢子萌發(fā)率和附著胞形成率；隨著萘乙酸濃度的升高，其促進作用會變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

殺菌劑對膠胞炭疽菌抑制作用的主要方式是抑制菌絲生長、芽管伸長和分生孢子萌發(fā)[7]。本試驗的結果與前人一般的藥劑敏感性結果一致，如鄭金龍通過9 種殺菌劑對柱花草膠孢炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定結果[8]，劉永剛采用抑菌圈法和孢子萌發(fā)法測定枸杞炭疽病菌對19種藥劑的敏感性以及各種藥劑對孢子萌發(fā)的抑制作用[9]，曲健祿采用菌絲生長速率法測定7 種常用殺菌劑對柿樹炭疽病菌的抑制作用[10]。本試驗發(fā)現(xiàn)萘乙酸對膠胞炭疽菌RC169的抑制作用屬于首次報道，萘乙酸對RC169孢子的萌發(fā)和附著胞的形成的促進作用也未見報道，其作用原理還需要進一步深入研究。

本實驗過程中，由于水分、光照、培養(yǎng)基厚度等因素的不一致，導致生長速率的測定結果不盡相同，給實驗結果造成一定的誤差；其次在孢子萌發(fā)率和附著胞形成率影響的測定過程中，由于每次滴在玻片上的水分、水瓊脂厚度、顯微鏡光線等因素不盡相同，致使實驗過程中，同一處理結果出現(xiàn)較大差異，這與以往文獻的報道相同[11-12]，更好更穩(wěn)定的測試方法還有待進一步的探索。

參考文獻

[1] 鄭肖蘭，崔昌華，鄭服叢，等. 橡膠炭疽病病原菌生物學特性初步研究[J]. 微生物學通報，2006，33（1）：95-99.

[2] 王蘭英，張 宇，鄭肖蘭，等. 8種殺菌劑對橡膠炭疽菌的抑制活性[J]. 農(nóng)藥，2010，03：16-20.

[3] 李 琳，崔昌華，鄭肖蘭，等. 海南島橡膠炭疽菌基礎生物學特性研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學，2007，04：24-27.

[4] 唐為萍，陳樹思，陳丹生，等. 萘乙酸對芥藍根、芽生