多種食源性致病菌快速檢測方法

劉曉

食品中污染的病原細菌是引起食源性疾病的主要因素之一，每年向衛(wèi)生部上報的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且大部分是由食源性致病菌引起的。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可見，食源性疾病與食品污染問題已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問題。因此，建立科學(xué)、準確、全面的食源性致病菌檢測體系，是保障食品安全的重要手段，對預(yù)防和控制微生物性食物中毒事件起著重要的作用。

目前對這些食源性致病菌的檢測，主要依靠常規(guī)的細菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需4～7d，操作繁瑣，費時耗力，檢驗的準確度不高，在檢測速度、敏感性與特異性等方面也有局限性。隨著微生物學(xué)的快速發(fā)展，食品微生物學(xué)檢驗中引入了越來越多的新技術(shù)，有關(guān)食源性致病菌檢測的免疫磁性分離法、酶聯(lián)免疫測定方法、核酸雜交技術(shù)和PCR技術(shù)因其特異性強、敏感性高、操作簡單快速而得到廣泛的應(yīng)用其中以高通量、靈敏、特異、適用范圍廣和低成本為特點的快速檢測方法受到越來越多的關(guān)注，而在這些方法中又以DNA檢測為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法應(yīng)用尤為廣泛。同時，常規(guī)培養(yǎng)檢測方法、基于免疫反應(yīng)的檢測方法等檢測手段也在進一步地完善和改進。本文通過探討目前常用食源性致病菌檢測方法，對不同方法的優(yōu)缺點進行闡述和分析。

常規(guī)食品微生物檢測方法包括反復(fù)增菌、菌落分離及多種生化和血清學(xué)鑒別實驗，食品中致病菌的常規(guī)培養(yǎng)檢測方法靈敏、穩(wěn)定、準確，并且檢測結(jié)束后可獲得目標致病菌，供后續(xù)研究，例如通過對從污染食品中檢出的致病菌和從臨床病人中分離的致病菌進行分析比較，并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，可以揭示污染食品和病人之間是否存在關(guān)聯(lián)，即是否是由于食用了污染食品而導(dǎo)致的臨床病例的出現(xiàn)，從而為食品安全預(yù)警提供實驗室的支持。正是由于這些優(yōu)點，所以截至到目前，世界上很多國家仍將常規(guī)培養(yǎng)檢測方法列為食品微生物檢測的金標準，例如我國的國家標準GB4789食品微生物檢測系列，美國食品藥品管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）的細菌分析手冊（BacteriologicalAnalyticalManual，BAM）等等。由此可見，食品中致病菌的常規(guī)培養(yǎng)檢測方法是從事食品微生物檢驗的技術(shù)人員所必須掌握的最基礎(chǔ)方法。如果能夠在此基礎(chǔ)上，結(jié)合一些以核酸分析為基礎(chǔ)的快速檢測方法，進行初步篩選，則可減少大量的工作，有效地提高檢測效率。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELLISA）

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的基本原理是將抗原或抗體預(yù)先吸附于固相載體表面，再加入受檢樣品和酶標抗體，進行免疫酶染色，最后經(jīng)固相載體上的酶催化產(chǎn)生顏色變化，從而判斷受檢樣品是否含有目的抗原。同時通過分析有色產(chǎn)物量可以確定樣品中待測物質(zhì)的含量。例如沙門氏菌ELLISA法是將細菌經(jīng)離心之后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，然后放在多孔板中固定，加抗鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛抗體作用，再加第二酶標抗體作尉，最后以底物顯色，產(chǎn)棕色或蘭色為陽性。這種方法最小檢出量可達10cfu/mL～10cfu/mL，其缺點是會引起假陽性反應(yīng)。國內(nèi)外學(xué)者采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對不同的細菌進行檢測，實驗結(jié)果表明ELISA法對多種食源性致病菌的靈敏度和特異性較好。但ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，且對結(jié)構(gòu)類似的化合物有交叉反應(yīng)。許多學(xué)者把其他方法與免疫學(xué)方法結(jié)合起來以提高檢測靈敏性，大大縮短了樣品檢測周期。

實時熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物及食品學(xué)科的眾多領(lǐng)域，尤其在食品中致病微生物檢測方面具有很大的應(yīng)用價值。熒光定量PCR技術(shù)巧妙地利用了PCR技術(shù)核酸擴增的高效性，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性以及計量高準確性等優(yōu)點，同時又克服了普通PCR技術(shù)易污染、不能定量、探針雜交靈敏度不高、分離洗脫條件不易控制等不足，在致病菌基因診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景。金大智等運用實時熒光PCR（Real—timePCR）技術(shù)建立對食品中單增李氏菌進行檢測的快速方法，設(shè)計的引物和探針的序列特異性強，省去凝膠電泳的繁瑣，降低了污染的可能性。以沙門氏菌的檢測為例，杜邦公司BAX系統(tǒng)不但能檢測到所有的沙門氏菌血清型，而且可以排除所有的非沙門氏菌菌株。在沒有使用PCR技術(shù)之前，所有的增菌方法都需要大量的手工操作。檢測人員操作技術(shù)差異，或因不斷轉(zhuǎn)移樣品而導(dǎo)致樣品發(fā)生交叉污染等原因，都會影響檢測結(jié)果的準確性，甚至出現(xiàn)假陽性。根據(jù)致病菌的特異基因序列，設(shè)計引物，進行熒光定量PCR檢測，是現(xiàn)階段檢測致病菌的最快速準確的方法。針對某種病原菌，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要長達1星期的時間才能得到檢測結(jié)果。而采用PCR技術(shù)，對絕大多數(shù)致病菌而言，在第二天就可以得到檢測結(jié)果。結(jié)果更為準確、可靠，而且還可改進成定量競爭PCR，對標本中靶序列進行定量。實時PCR操作簡單，閉管檢測，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過程進行同步定性或定量檢測，而且可以進行大規(guī)?？焖贆z測。

食品中致病菌的快速定量、定性的檢測是確保食品安全的前提，在該領(lǐng)域目前仍有許多問題需要解決，如提高分析靈敏度及重復(fù)性、降低自動化儀器和試劑成本、簡化樣品處理及多基因同時分析等。食源性致病菌檢測技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新過程中，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)勢。應(yīng)該指出的是，快速檢測方法的應(yīng)用并不意味著完全拋棄分離培養(yǎng)方法。在某些情況下，特別是涉及一些需要最終結(jié)果的樣品時，常規(guī)培養(yǎng)檢測方法還是必不可少的，也是世界上公認的標準。

（作者單位：山東省青島市黃島區(qū)檢驗檢測中心）