家養(yǎng)野豬腦心肌炎病毒的分離、鑒定及全基因組序列分析

常洪濤，劉慧敏，趙 軍，陳 陸，楊 霞，王新衛(wèi)，姚惠霞，王川慶

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患疫病病原[1]，屬小RNA病毒科、心病毒屬，可以感染豬、野生動物、嚙齒動物和靈長類動物等[2-3]，近年來人感染發(fā)病也時有發(fā)生[4-5]。自然條件下，鼠類是EMCV的自然貯存宿主和傳播者[6-7]，但其感染最廣泛和最嚴(yán)重的動物是豬，臨診上主要引起母豬繁殖障礙及斷奶仔豬的腦炎、心肌炎和急性死亡等[8-9]。自1958年巴拿馬豬群中首次發(fā)生疫情以來，許多國家相繼報(bào)道了該病的存在和發(fā)生。中國自2005年從疑似病死豬體內(nèi)成功分離到首株EMCV并作較多研究[10-17]。特對家養(yǎng)野豬EMCV河南株進(jìn)行分離、鑒定和全基因組測序解析，以期了解不同豬種對EMCV的易感情況。

1 材料與方法

1.1病料采集和病毒的分離鑒定 2012年5月收集河南省焦作市某養(yǎng)豬場送檢的疑似發(fā)病家養(yǎng)野豬的心臟、淋巴結(jié)和脾臟等標(biāo)本，-20 ℃凍存待用。病毒分離、電鏡觀察和初步鑒定等工作均參考蓋新娜等[10]的方法進(jìn)行。

1.2RT-PCR及測序 取分離毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用TRIZOL提取總RNA。參考文獻(xiàn)[18]中的各片段特異性引物和反應(yīng)條件，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、基因克隆和序列測定。并應(yīng)用Chromas2.33軟件進(jìn)行拼接，獲得全基因組序列。

1.3同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析 運(yùn)用MegAlign程序，將分離毒全基因組序列與19株從NCBI GenBank搜集下載的EMCV參考毒株的基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1病毒分離及鑒定 從疑似病料組織中成功分離到1株家養(yǎng)野豬EMCV，命名為JZ1202株。在透射電鏡下可以清晰觀察到數(shù)個形狀規(guī)則，直徑大小約為25～29 nm的圓形病毒粒子(圖1)。1～4代分離毒細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50經(jīng)測定，分別為10-6.32/0.1 mL、10-5.9/0.1 mL、10-7.42/0.1 mL和10-7.63/0.1 mL；分離毒經(jīng)終濃度為4.8%分析純氯仿處理后，其TCID50為10-5.78/0.1 mL，略低于對照組的10-7.63/0.1 mL，但仍可判定為不敏感；分離毒經(jīng)1%胰蛋白酶溶液37 ℃消化1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.94/0.1 mL，說明對胰蛋白酶較為敏感；病毒液在pH3.0的酸性環(huán)境中作用1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.53/0.1 mL，表明該分離毒不耐酸；將分離毒分別置于37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃時處理1 h，發(fā)現(xiàn)37 ℃時病毒滴度并無明顯變化，50 ℃時其TCID50由10-7.18/0.1 mL降低至10-4.25/0.1 mL，60 ℃時已完全失活，失去感染力，從而表明該分離株對熱敏感；將分離株置于1.1 mol/L MgCL2溶液中50 ℃水浴1 h，測定TCID50為10-4.32/0.1 mL，與對照組的10-3.99/0.1 mL差異不明顯，說明二價(jià)陽離子對分離毒并未有保護(hù)作用。

圖1JZ1202株感染BHK-21超微形態(tài)電鏡圖

Fig.1UltrastructuralmorphologicfeaturesofJZ1202strain-infectedBHK-21cellscollectionsofpicornavirusparticles

2.2病毒基因組序列及結(jié)構(gòu)分析 通過序列拼接，JZ1202株的基因組全長為7 735 bp(GenBank：KF836387)，其中5′-UTR包含724 bp，3′-UTR包含132 bp，中間為一個大的ORF(6 879 bp)編碼的由2 292個氨基酸組成的多聚蛋白，該多聚蛋白可切割成1個病毒自身編碼的前導(dǎo)蛋白(L)和11個蛋白終產(chǎn)物(1A～1D、2A～2C和3A～3D)(圖2)。

圖2 JZ1202株的全基因組結(jié)構(gòu)圖

2.3病毒全基因組及各基因片段的同源性比較 全基因組序列分析結(jié)果表明，JZ1202株與國內(nèi)外不同動物源EMCV參考毒株的核苷酸同源性為81.2%～99.9%，其中與國內(nèi)豬源分離毒(GXLC、GX0601、BJC3、HB1、NJ08和BD2)的同源性高達(dá)99.4%以上，與韓國豬源分離毒(CBNU、K3和K11)和歐美豬源分離毒(PV21、EMC-D、D variant和EMCV-30)的同源性分別為99.4%～99.6%和83.6%～99.3%，與國內(nèi)(GX0602)、外(PEC9和Rz-pMwt)鼠源毒株的同源性分別為99.4%和81.3%～99.5%。進(jìn)而與參考毒株ORF和各基因片段的核苷酸、氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)JZ1202株結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1變異幅度最大，VP2最為保守；非結(jié)構(gòu)蛋白中，2A變異幅度最大，3D最為保守；非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)相比結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)較為保守。將VP1蛋白與國內(nèi)豬源EMCV比較后發(fā)現(xiàn)，氨基酸變異多發(fā)生在7～63位，7位由K→R，13位與GXLC均由A→T，63位與BD2、BJC3、HB1均為Q，不同于GX0601和GCLX的G。

2.4病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于JZ1202株全基因組、ORF和VP1基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示(圖3)，可見EMCV分為 G1、G2和G3 3個群。豬源EMCV主要分布在G1群和G2群，鼠源 EMCV 在G1群和G3群中均有分布。JZ1202株與HB1親緣關(guān)系最近，并與國內(nèi)的良種豬源、鼠源和華南虎源EMCV同屬于G1群。

圖3 基于JZ1202株全基因組(A)、ORF(B)和VP1基因(C)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前感染人的病原體中60%屬于人獸共患病，而這些病原體71%以上源于野生動物。近年來，野豬及相關(guān)產(chǎn)品作為綠色食品的重要來源之一，因其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味而日益?zhèn)涫芮嗖A，國內(nèi)各地都在進(jìn)行野豬資源的開發(fā)利用，如野豬家養(yǎng)或作為父本經(jīng)濟(jì)雜交以滿足人們的消費(fèi)需求。但隨之而來的問題是，由于野生生態(tài)環(huán)境改變，接觸家豬機(jī)會頻繁以及屠宰、加工、消費(fèi)環(huán)節(jié)中存在的風(fēng)險(xiǎn)因素，都使得野豬攜帶多種病原體并感染家畜和人類變成可能。國內(nèi)已分離到多株良種豬源EMCV，但有關(guān)家養(yǎng)野豬源EMCV的研究尚未見報(bào)道，因此開展其分離、鑒定和遺傳演化工作，可為研究EMCV的分子流行病學(xué)特征、分子生態(tài)學(xué)、疫苗毒株篩選和制定綜合防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

JZ1202株分離自家養(yǎng)野豬，通常情況下該豬種抗病力極強(qiáng)，而該毒株的成功分離證實(shí)EMCV可感染家養(yǎng)野豬并導(dǎo)致發(fā)病，但其是否來源于良種豬或是由于傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式改變而導(dǎo)致的自身內(nèi)源感染，則有待進(jìn)一步研究。另外，EMCV在疑似病料組織中的含量很低，生產(chǎn)中也多表現(xiàn)為亞臨床感染，因此病毒的直接分離、鑒定等工作難以直接開展。筆者曾多次嘗試應(yīng)用常規(guī)RT-PCR方法從病料中直接檢測EMCV，但從未獲得成功。由于豬瘟病毒(SCFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)等多種豬重要病毒性病原均無法在BHK-21細(xì)胞上增殖，而EMCV接種后則很快能出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)。因此，作者先將疑似病料處理后接種BHK-21細(xì)胞，一旦出現(xiàn)CPE后再用RT-PCR方法進(jìn)行檢測，最終成功分離到國內(nèi)首株家養(yǎng)野豬源EMCV。這種改進(jìn)的“細(xì)胞接種與RT-PCR方法相結(jié)合”技術(shù)，一方面可利用細(xì)胞接種技術(shù)進(jìn)行初步鑒定，另一方面則大幅提高了病料組織中EMCV的檢出率和分離率。

開展不同豬種EMCV地方分離株的基因組序列測定與分析，對豐富病毒流行病學(xué)資料和研究病毒結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系至關(guān)重要。本研究成功獲得JZ1202株全基因組序列，分析結(jié)果表明，該病毒與國內(nèi)豬源EMCV分離毒株高度同源，說明可能彼此間交叉感染或具有共同感染來源，從而提醒我們在進(jìn)行野生動物養(yǎng)殖活動中要充分考慮人獸共患疫病傳播的生態(tài)學(xué)。另外，該毒株與韓國分離株的親緣關(guān)系較近，與絕大多數(shù)歐美分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與德國分離株X74312的同源性高達(dá)99.3%，從而提示EMCV存在較大的地域差異，但傳播應(yīng)有一定范圍內(nèi)的區(qū)域限制性，日益發(fā)達(dá)的國際交通和貿(mào)易可能會加速EMCV的擴(kuò)散。

現(xiàn)有研究表明，EMCV在豬只之間傳播能力有限，而鼠類等嚙齒目動物在豬群EMCV的傳播過程中具有重要作用。在本研究中，JZ1202株與國內(nèi)鼠源毒株的同源性高達(dá)99.6%，親緣關(guān)系極近，從而提示EMCV在家養(yǎng)野豬和鼠之間可能存在著交叉感染與傳播，但要對鼠在EMCV傳播中的精確定位仍需做進(jìn)一步研究，而做好豬場內(nèi)及周邊的滅鼠工作，卻無疑會對有效防控豬EMCV感染至關(guān)重要。

VP1基因是EMCV基因組中最重要的中和性抗原表位所在區(qū)域，變異幅度最大，其氨基酸序列與致病性密切相關(guān)，因此對其開展相關(guān)研究最具價(jià)值。本研究通過對JZ1202株與國內(nèi)豬源參考毒株的全基因組、ORF和各基因片段進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)彼此間盡管同源性很高，但VP1蛋白已出現(xiàn)細(xì)微變異，提示EMCV在感染家養(yǎng)野豬時可能會發(fā)生個別氨基酸的突變，以適應(yīng)新的豬種。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zimmerman J,Allaire SD,Taylor DJ.Disease of swine[M]. 9thed. Oxford: Blackwell Publishing Professional,2006: 331-336.

[2]Liu HM,Yan Q,Zhao B,et al. Isolation,molecular characterization,and phylogenetic analysis ofencephalomyocarditisvirus from South China tigers in China[J]. Infect Genet Evol,2013,19: 240-243. DOI: 10.1016/j.meegid.2013.07.023

[3]Yuan WZ,Song QY,Zhang XY,et al. Isolation and molecular analysis of porcineencephalomyocarditisvirus strain BD2 from northern China[J]. Infect Genet Evol,2014,21: 303-307. DOI: 10.1016/j.meegid.2013.11.014

[4]Deutz A,Fuchs K,Nowotny N,et al. Sero-epidemiological studies of zoonotic infections in hunters-comparative analysis with veterinarians,farmers,and abattoir workers[J]. Wien Klin Wochenschr,2003,115(3): 61-67.

[5]Oberste MS,Gotuzzo E,Blair P,et al. Human febrile illness caused byencephalomycarditisvirus infection. Peru[J]. Emerg Infect Dis,2009,15: 640-646. DOI: 10.3201/eid1504.081428

[6]Seaman JT,Boulton JG,Carrigan MJ.Encephalomyocarditisvirus disease of pigs associated with a plague of rodents[J]. Aust Vet J,1986,63: 292-294. DOI: 10.1111/j.1751-0813.1986.tb08069.x

[7]Billinis C.Encephalomyocarditisvirus infection in wildlife species in Greece[J]. J Wild Dis,2009,45(2): 522-526.

[8]Gelmetti D,Meroni A,Brocchi E,et a1. Pathogenesis ofencephalomyocarditisexperimental infection in young piglets: a potential animal model to study viral myocarditis[J]. Vet Res,2006,37: 15-23. DOI: 10.1051/vetres:2005041

[9]Bai J,Jiang FK,Li YF,et al. Analysis of the complete sequence of a porcineencephalomyocarditisvirus isolate NJ08 from China[J]. Chin J Prev Vet Med,2011,33(5): 402-404. (in Chinese)

白娟,蔣康富,李玉峰,等.豬腦心肌炎病毒NJ08株基因組序列測定與分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(5):402-404.

[10]Ge XN,Yang HC,Guo X,et al. Isolation and characterization of porcineencephalomyocarditisvirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2007,38(1): 59-65. (in Chinese)

蓋新娜,楊漢春,郭鑫,等.豬腦心肌炎病毒的分離與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,38(1):59-65.

[11]Zhang GQ,Ge XN,Guo X,et al.Genomie analysis of two porcineencephalomyocarditisvirus strains isolated in China[J]. Arch Virol,2007,152: 1209-1213. DOI: 10.1007/s00705-006-0930-9

[12]Zhang JL,Ge XN,Ma L,et al. Serological survey of EMCV infection in pigs on large-scale pig farms in China 2005-2006[J]. Chin J Vet Med,2007,43(1): 7-9. (in Chinese)

張家龍,蓋新娜,馬良,等.規(guī)模化豬場腦心肌炎病毒的血清學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43(1):7-9.

[13]Zhao T,Zhang JL,Ge XN,et al. Comparative analysis virus isolates of the genomes of from porcine andencephalomyocarditismouse origin[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2009,40(6): 873-878. (in Chinese)

趙婷,張家龍,蓋新娜,等.豬源和鼠源腦心肌炎病毒分離株基因組的比較分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(6):873-878.

[14]Chen JX,Shi KC,Huang SB,et al. Isolation of porcineencephalomyocarditisvirus GXLC strain and analysis of the molecular characteristics of its 3D gene[J]. Chin Ani Husb Vet Med,2011,38(1): 81-87. (in Chinese)

陳進(jìn)喜,施開創(chuàng),黃勝斌,等.豬腦心肌炎病毒GXLC株的分離及其3D基因分子特征的分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(1):81-87.

[15]Knipe DM,Howley PM,Griffin DE,et al. Fields virology[M]. 4thed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins Publishers,2001: 685-715.

[16]Suh YS,Ha SJ,Lee CH,et al. Enhancement of VP1-specific immune response and protection against EMCV-K challenge by co-delivery of IL-12 DNA with VP1 DNA vaccine[J]. Vaccine,2001,19(15-16): 1891-1898. DOI: 10.1016/S0264-410X(00)00443-6

[17]Koenen F,Vanderhallen H,Castryck F,et al. Epidemiologic,pathogenic and molecular analysis of recentencephalomyocarditisoutbreaks in Belgium[J]. Zentralbl Vet Med B,1999,46(4): 217-231. DOI: 10.1111/ j.0931-1793.1999.0_216.x

[18]Lin WC,Liu YB,Cui SJ,et al. Isolation,molecular characterization,and phylogenetic analysis of porcine encephalomyocarditis virus strain HB10 in China[J]. Infect Genet Evol,2012,12: 1324-1327. DOI: 10.1016/j.meegid.2012.04.008