豇豆愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究

陳高　陳禪友　高志鵬　宋靖儀　吳華

摘要：研究了不同濃度的生長(zhǎng)素（NAA、2，4-D）和細(xì)胞分裂素（6-BA、KT）對(duì)豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]花榮下胚軸和子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，子葉較下胚軸更容易誘導(dǎo)出愈傷組織；子葉切片在MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT中愈傷誘導(dǎo)率最高，為95.83%，下胚軸莖段在MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA中愈傷誘導(dǎo)率最高，為88.89%。此外，2，4-D與KT組合可誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生胚狀體。

關(guān)鍵詞：豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walt）.]；外植體；愈傷組織；誘導(dǎo)；生長(zhǎng)素；細(xì)胞分裂素

中圖分類號(hào)：S643.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2380-03

豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]是豆科豇豆屬一年生草本植物。豇豆在中國(guó)品種資源豐富，歷史悠久，適應(yīng)性強(qiáng)，栽培范圍廣，是中國(guó)夏秋兩季主要食用的蔬菜之一。新鮮的豇豆莢，維生素及礦物質(zhì)含量豐富，蛋白質(zhì)含量較高，其磷脂有利于促進(jìn)胰島素的分泌，是糖尿病人的理想食物。

植物組織培養(yǎng)是細(xì)胞工程技術(shù)中研究較早、較成熟的技術(shù)。在育種上已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，如單倍體育種、細(xì)胞融合和基因工程等。此外。植物組織培養(yǎng)技術(shù)還被運(yùn)用到人工種子的生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保存上，大大節(jié)約了人力、物力，避免了外界氣候和其他環(huán)境因素對(duì)播種的影響。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)豇豆組織培養(yǎng)進(jìn)行了一些研究，包括基因型、外植體種類和大小、培養(yǎng)基種類、凝固劑、細(xì)胞分裂素前處理以及激素種類與配比等對(duì)不定芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響?；蛐秃屯庵搀w類型對(duì)不定芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異明顯，至今尚未形成一種比較通用的豇豆不定芽和愈傷誘導(dǎo)的組培體系。本試驗(yàn)以豇豆花榮的下胚軸、子葉作為外植體進(jìn)行豇豆愈傷組織誘導(dǎo)，研究不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不同影響，找到適合豇豆花榮愈傷組織誘導(dǎo)的理想培養(yǎng)基，為豇豆的組織快速繁殖和品種改良研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豇豆花榮種子，由湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心提供。

選擇無(wú)皺粒、飽滿、大小均勻的豇豆種子，用75%乙醇浸泡消毒40s后，經(jīng)無(wú)菌水沖洗2-3次：然后用升汞浸泡消毒9～10min，再用無(wú)菌水沖洗6-8次。將消毒后的種子接種于裝有MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶4-5粒，在（23±2）℃、16/8h光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。種子萌發(fā)后，當(dāng)幼苗高達(dá)到5-6cm、子葉轉(zhuǎn)綠時(shí)作為外植體材料。

1.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)無(wú)菌苗不同部位愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別切取幼苗的下胚軸和子葉作為外植體，接種至含有不同濃度NAA或2，4-D（1.0、3.0、5.0mg/L）與6-BA或KT（0、0.1、0.5mg/L）的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種4皿，每皿接種12-16個(gè)外植體，4次重復(fù)。其中下胚軸切取大小在5mm左右，子葉橫切段厚度在2mm左右。每15d換一次新鮮培養(yǎng)基，所有材料均是在（23±2）℃、16/8h光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

接種后，每3d觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，并記錄愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織色澤狀態(tài)等相應(yīng)指標(biāo)。同時(shí)進(jìn)行拍照記錄和形態(tài)解剖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

愈傷分化率：誘導(dǎo)出愈傷的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%：褐化率：褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%：胚狀體誘導(dǎo)率：誘導(dǎo)出胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%，所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel2003和SAS8.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對(duì)豇豆子葉愈傷組織誘導(dǎo)的效果

預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，豇豆轉(zhuǎn)綠且飽和的子葉較白色或轉(zhuǎn)綠萎蔫的子葉愈傷誘導(dǎo)效果更佳，因此，本試驗(yàn)中均采用轉(zhuǎn)綠且飽和的子葉進(jìn)行試驗(yàn)。不同生長(zhǎng)索及細(xì)胞分裂索處理對(duì)豇豆子葉切片15d愈傷誘導(dǎo)效果的差異明顯（表1）。由表1可知，2，4-D比NAA更利于子葉愈傷組織誘導(dǎo)分化，隨著2，4-D濃度的增高，褐化率明顯降低，在3.0mg/L2.4-D+0.1mg/L6-BA培養(yǎng)基中，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最高（100%），且額外添加KT比6-BA能顯著增加愈傷組織中胚狀體的形成比例。

MS+3.0mz/L2，4-D+0.5mg/LKT配置的培養(yǎng)基上形成的愈傷組織色澤黃亮，顆粒飽滿，易分散，而褐化率僅為34.58%。切片分析結(jié)果表明，愈傷組織中所形成的胚狀體。細(xì)胞壁薄。原生質(zhì)較濃、細(xì)胞核較大，細(xì)胞正處于旺盛的分裂狀態(tài)，生長(zhǎng)速度快。由此可見，MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT是豇豆花榮子葉愈傷誘導(dǎo)與胚狀體誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)率為95.83%，胚狀體誘導(dǎo)率為78.13%。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)豇豆下胚軸愈傷組織的影響

表2結(jié)果表明，2種生長(zhǎng)素均能誘導(dǎo)豇豆下胚軸愈傷的形成，但在加入相同濃度的6-BA或KT時(shí)，2，4-D的愈傷誘導(dǎo)率較高、愈傷較為疏松，且褐化率明顯降低。研究中發(fā)現(xiàn)，在2，4-D濃度相同。添加同濃度6-BA或KT時(shí)，KT的愈傷誘導(dǎo)率大部分高于6-BA，誘導(dǎo)出的愈傷大多為淡黃色。后期培養(yǎng)更易褐化。由此可見，MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA是豇豆花榮最佳的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)率為88.89%，褐化率為34.44%。

3 小結(jié)與討論

愈傷誘導(dǎo)會(huì)因外植體的年齡、部位、生理狀況而有所差異。包英華等研究豇豆豐產(chǎn)2號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)愈傷誘導(dǎo)率下胚軸>頂芽>上胚軸>真葉。本研究中，發(fā)現(xiàn)豇豆花榮子葉較下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率高，且子葉能夠誘導(dǎo)出胚狀體。

植物生長(zhǎng)素是影響外植體愈傷誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵。在豇豆愈傷誘導(dǎo)的研究中，Ramakrishnan等和Anand等發(fā)現(xiàn)1.5mg/L的2，4-D對(duì)胚性愈傷的誘導(dǎo)效果，在胚性愈傷及原胚形成這個(gè)階段是最好的。對(duì)豇豆未成熟胚進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)，較高濃度的2，4-D和較低濃度的6-BA配合使用，胚性愈傷的誘導(dǎo)率更高。在豇豆豐產(chǎn)2號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)的研究中，愈傷誘導(dǎo)率也因外源激素的濃度不同而有所差別，NAA和2，4-D的愈傷誘導(dǎo)效果大致相同，其最佳用量為2.0mg/L。本研究中發(fā)現(xiàn)，2，4-D對(duì)子葉和下胚軸的誘導(dǎo)效果均優(yōu)于NAA，褐化情況較少。當(dāng)2，4-D達(dá)到3.0mg/L時(shí)，只需要3～6d便能啟動(dòng)愈傷組織的發(fā)生，平均誘導(dǎo)率可高達(dá)70%。而NAA誘導(dǎo)的愈傷出愈率低。易褐化。但有利于生根。KT與2，4-D組合有利于子葉的愈傷誘導(dǎo)和胚狀體的形成，而6-BA與2，4-D組合有利于下胚軸的愈傷誘導(dǎo)。

褐化主要是酶促褐變，而酶促褐變主要是由多酚氧化酶引起的。植物種類和基因型、外植體部位和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件是影響褐化的因素。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，子葉比下胚軸莖段褐化嚴(yán)重，凡是較小、較薄、綠色較淺、帶有機(jī)械傷的子葉容易發(fā)生褐化，較嫩帶綠色的下胚軸褐化較輕，而較老的褐化較重。為了避免褐化過于嚴(yán)重，試驗(yàn)中縮短了繼代周期，有效地改善了褐化。