山雞椒根揮發(fā)油GC—MS特征成分及指紋圖譜研究

趙歐　劉真美　班大明

摘要：利用氣相色譜建立山雞椒（Litsea cubeba）根部揮發(fā)油的指紋圖譜，用水蒸氣蒸餾法提取10批黔產(chǎn)山雞椒根部揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測(cè)，以β-檸檬醛為對(duì)照，使用浙江大學(xué)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件計(jì)算有關(guān)參數(shù)。結(jié)果標(biāo)定了7個(gè)共有峰，這7種成分的相對(duì)含量共約占揮發(fā)油總成分的86.8%～92.3%，其保留時(shí)間和峰面積形成了特征-性指紋圖譜。結(jié)果表明，指紋圖譜和定性分析相結(jié)合可作為山雞椒根部的鑒定和內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：山雞椒（Litsea cubeba）根；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：R931.71；0657.7；Q586 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2356-03

山雞椒（Litsea cubeba）為樟科木姜子屬落葉灌木，俗稱(chēng)山蒼子、木姜子，分布于湖北、湖南、四川、廣西、貴州、云南、甘肅、河南、陜西等地。資源豐富。山雞椒揮發(fā)油廣泛存在于葉、花、果實(shí)、樹(shù)皮和根中。山雞椒揮發(fā)油是由近30種化學(xué)物組成的，已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分有近20個(gè)，主要為檸檬醛。含量一般在60%以上，其次是檸檬烯、甲基庚烯酮、丁香酚、蒎烯、茨烯、芳樟醇、香葉醇、月桂烯等。對(duì)山雞椒果實(shí)揮發(fā)油的研究比較多，但對(duì)于其根部揮發(fā)油的研究較少。山雞椒根也可以入藥，在山雞椒的綜合利用方面進(jìn)行了多領(lǐng)域的研究探索，但尚未形成從品種、栽培到科學(xué)提取分離、副產(chǎn)品加工利用的科學(xué)合理的開(kāi)發(fā)體系。利用氣相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高鑒別能力，對(duì)貴州山雞椒的根部成分進(jìn)行檢測(cè)與鑒定，通過(guò)對(duì)貴州各地區(qū)山雞椒根部油含量和有效成分的分析評(píng)價(jià)并建立其指紋圖譜，對(duì)山雞椒在創(chuàng)制成藥新品種、天然香料及綜合利用等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-MS聯(lián)用儀、揮發(fā)油提取器、浙大指紋圖譜研究軟件等；10批山雞椒根（具體見(jiàn)表1）；正己烷等化學(xué)試劑。

1.2 分析條件

島津GC/MS-QP2010聯(lián)用儀，載氣He，石英毛細(xì)管柱SE-54MS，30m×0.25mm×0.25μm，升溫程序60℃保持4min，以5℃/min升至185℃保持1min。以6℃/min升至190℃，保持1min。柱前壓80kPa。柱流量1mL/min，進(jìn)樣量0.6μL。進(jìn)樣口溫度270℃。分流比10：1。離子源為EI，電離能70eV，離子源溫度270℃，質(zhì)量范圍m/z30-400：掃描周期1s。

1.3 山蒼子根部揮發(fā)油的提取

分別取100克山蒼子根部粗粉，加200mL水用揮發(fā)油提取器提取5h，至近干時(shí)，收集揮發(fā)油并稱(chēng)重，獲得具有特殊香味的黃色液體。用于氣相色譜一質(zhì)譜分析。

1.4 試驗(yàn)方法

測(cè)定方法：精密吸取供試品溶液0.6μL，注入氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析測(cè)定，以基線(xiàn)分離度良好的12號(hào)峰（β-檸檬醛）為自身內(nèi)標(biāo)，指定各樣品中β-檸檬醛參照峰（S）的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積值為1，計(jì)算10批樣品中特征性成分相對(duì)保留時(shí)間（RTR）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

分析時(shí)間考察：吸取4號(hào)供試品溶液0.6μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用儀。運(yùn)行40min，記錄色譜圖，發(fā)現(xiàn)33min以后已無(wú)明顯色譜峰，因此分析時(shí)間定為40min。

精密度測(cè)定：精密吸取同一樣品（4號(hào)）供試液各0.6μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果26個(gè)峰面積較大的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.00%-0.06%，相對(duì)峰面積的RSD為0.99%-2.03%，表明方法的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一樣品（4號(hào)）供試液各0.6μL，分別于0、2、4、8、24h進(jìn)樣。結(jié)果11個(gè)峰面積較大的共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01%～0.35%，相對(duì)峰面積的RSD為0.15%-3.02%，表明供試品溶液在24h內(nèi)測(cè)定指紋圖譜是穩(wěn)定的。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一樣品（4號(hào)）按“1.3”平行制備5份平行供試液進(jìn)樣測(cè)定。11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%-1.18%，面積百分比基本一致，RSD小于1%，表明方法重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS定性定量分析

取山蒼子根部揮發(fā)油0.6μL（正己烷溶液），按“1.3”方法制備10批樣品的供試，按“1.2”條件取供試液0.6μL進(jìn)樣測(cè)定，得總離子流色譜（圖1），用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測(cè)，通過(guò)島津GC-MS-QP2010化學(xué)工作站檢索標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)解析，確認(rèn)各地區(qū)山雞椒揮發(fā)油的化學(xué)成分。峰面積相對(duì)百分含量分析通過(guò)島津GC-MS-QP2010化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，求得各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。

2.2 共有特征性成分指紋峰的確定

比較各樣品的GC-MS分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10批樣品中存在11個(gè)共有化學(xué)成分，其中有7種特征成分的峰面積較大，相對(duì)含量共占揮發(fā)油總成分的86.8%-92.3%，且與計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)中化合物的匹配度均大于等于90%：而其他成分的峰面積較小，相對(duì)含量為7.7%-13.2%，且部分化合物匹配度小于80%或難以準(zhǔn)確鑒定。故確定上述7種共有成分的色譜峰作為黔山雞椒揮發(fā)油特征性成分指紋峰。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

采用浙大指紋圖譜處理軟件，將工作站數(shù)據(jù)按軟件要求轉(zhuǎn)換為規(guī)定數(shù)據(jù)格式Excel文件，采用夾角余弦算法。計(jì)算7個(gè)特征成分的RTR、相對(duì)峰面積與指紋圖譜共有模式的相似度。10批樣品的相對(duì)峰面積和之均值除樣品7號(hào)為0.57（最?。瑯悠?號(hào)為2.722（最大），其他8個(gè)樣品均在0.572-2.700之間。

3 小結(jié)與討論

1）采用程序升溫使10批山蒼子根部揮發(fā)油的22個(gè)色譜峰均在40min內(nèi)分離完全，在該條件下所獲得的TIC圖中大部分化學(xué)成分色譜峰的分離度均良好。它們的保留時(shí)間和峰豐度極具規(guī)律性，形成了山蒼子根部揮發(fā)油獨(dú)特的GC-MS指紋圖譜。使用GC-MS重點(diǎn)分析出最能代表山蒼子根部揮發(fā)油特征的7種化學(xué)成分為α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、桉油精、香茅醛、檸檬醛、（E）-檸檬醛，作為山蒼子根部揮發(fā)油的特征成分。

2）采用浙大指紋圖譜處理軟件，將工作站數(shù)據(jù)按軟件要求轉(zhuǎn)換為規(guī)定數(shù)據(jù)格式Excel文件，采用夾角余弦算法。計(jì)算7個(gè)特征成分的RTR、相對(duì)峰面積與指紋圖譜共有模式的相似度。10批樣品的相對(duì)峰面積和之均值除樣品7號(hào)為0.57（最小），樣品1號(hào)為2.722（最大）。其他8個(gè)樣品均在0.5722.700之間。

3）特征性成分指紋圖譜可以標(biāo)識(shí)中藥的化學(xué)特征，最大限度展示中藥的整體內(nèi)在品質(zhì)。為了對(duì)貴州產(chǎn)山雞椒資源建立客觀(guān)、整體和多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)體系，本試驗(yàn)以其所含揮發(fā)性成分為控制指標(biāo)對(duì)貴州產(chǎn)地的10批山蒼子樣品進(jìn)行了測(cè)定，以β-檸檬醛為參照峰，得到穩(wěn)定的共有指紋峰，建立了山雞椒根部揮發(fā)油的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可作為山雞椒根部的鑒定和內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。