豇豆葉噴細(xì)胞分裂素后光譜、熒光參數(shù)與葉綠素含量的相關(guān)性分析

胡志輝　汪艷杰　蘭紅　郭瑞　陳高　陳禪友

摘要：試驗(yàn)對(duì)豇豆（Vigna unguiculata）葉片進(jìn)行了葉綠素?zé)晒鈨x和光譜儀參數(shù)的測(cè)定，以及用傳統(tǒng)方法測(cè)定了葉片葉綠素含量，篩選了17個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析和逐步回歸分析。結(jié)果表明，PAR與NPO、Y（NPO）、Fm差異極顯著，Y（Ⅱ）與Y（NO）差異極顯著，qL與PRI差異顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)，其他指標(biāo)間差異都不顯著。CR，1與CNDVI差異顯著，CNDVI與CRI1、PRI差異顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)，與ARI1差異極顯著，呈顯著正相關(guān)，NDVI與PSRI差異極顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)逐步回歸得到的6個(gè)顯著指標(biāo)對(duì)葉綠素的直接作用為：Y（NPQ）（X₆）>ARI1（X₁₅）>Fm（X₁₄）>PRI（X14）>qL（X₄）>NPQ（x₄）。Y（NPQ）和ARI1兩個(gè)自變量對(duì)目標(biāo)性狀具有較大的直接通徑系數(shù)，qL和NPO對(duì)葉綠素含量的直接通徑系數(shù)均較小。NPO對(duì)葉綠素含量的影響主要是通過(guò)Y（NPO）、Fm、PRI，ARI1發(fā)生的，PRI對(duì)葉綠素含量的影響主要是通過(guò)ARI1發(fā)生的?？梢圆捎没貧w方程快速擬合豇豆葉片葉綠素含量的值。

關(guān)鍵詞：豇豆（Vigna unguiculata）；熒光；光譜；葉綠素含量；相關(guān)分析；逐步回歸

中圖分類(lèi)號(hào)：S643.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2290-05

光合作用是綠色高等植物從外界環(huán)境獲取能量的途徑，是進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，葉綠素含量的高低直接影響到植物光合作用的速率和強(qiáng)度，從而影響植物的產(chǎn)量。當(dāng)植物發(fā)生衰老時(shí)，葉綠素含量降低，葉綠素含量可作為衰老的一個(gè)指標(biāo)。張治禮等認(rèn)為葉片衰老將嚴(yán)重影響有效光合作用時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)體構(gòu)建，最終影響子粒產(chǎn)量。植株葉片吸收的光能一部分被葉綠素利用進(jìn)行光合作用，另一部分以長(zhǎng)波的形式散發(fā)熒光，或者以熱的形式向外耗散。將綠色植物組織暗適應(yīng)后，在可見(jiàn)光下激發(fā)。用熒光計(jì)檢測(cè)。可發(fā)現(xiàn)植物綠色組織發(fā)出一種微弱的、強(qiáng)度不斷變化的熒光信號(hào)，即為葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)。葉綠素?zé)晒鈪?shù)與光合作用中各種反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)，任何環(huán)境因子對(duì)光合作用的影響都可通過(guò)葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)反映出來(lái)。隨著遙感技術(shù)的發(fā)展，利用特殊波段的光譜反射率來(lái)估計(jì)植物葉綠素含量越來(lái)越受重視。楊峰等認(rèn)為根腐病脅迫下光譜特征指數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)與光合色素之間存在很好的相關(guān)性。因此，高光譜遙感技術(shù)作為監(jiān)測(cè)作物光合色素和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的方法具有可行性。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，有目標(biāo)地調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素系統(tǒng)，是保障品種優(yōu)良遺傳性狀和抗逆潛能充分發(fā)揮的新技術(shù)資源。在植株的不同生育階段或者外界環(huán)境脅迫條件下噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，會(huì)發(fā)現(xiàn)植株的葉綠素含量發(fā)生不同程度的變化，從而影響植株的光合速率。

細(xì)胞分裂素能刺激植物細(xì)胞分裂，促進(jìn)葉綠素形成，增強(qiáng)植物光合作用。具有促進(jìn)生長(zhǎng)，提早成熟，催花保果，增加產(chǎn)量等功能。研究噴施細(xì)胞分裂素后植物葉片光譜參數(shù)、熒光參數(shù)的變化，能夠在微觀(guān)層次上了解植物光合系統(tǒng)的光能吸收、轉(zhuǎn)換和利用效率，探明細(xì)胞分裂素對(duì)植物的作用機(jī)理。因此，針對(duì)上述問(wèn)題，以通過(guò)國(guó)家審定的適合在湖北種植的4個(gè)豇豆（Vigna unguiculata）品種為試驗(yàn)材料，應(yīng)用細(xì)胞分裂素為調(diào)控手段，檢測(cè)豇豆葉片葉綠素含量的變化，以期提高豇豆光合能力，從而為提高豇豆的產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鄂豇豆6號(hào)（商品名柳翠），植株蔓生，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。分枝少，持續(xù)結(jié)莢能力強(qiáng)，中熟，莢綠色。長(zhǎng)圓條形。鄂豇豆2號(hào)（商品名早翠），植株蔓生，生長(zhǎng)勢(shì)旺。無(wú)分枝或1個(gè)分枝：始花節(jié)位3～4節(jié)，早熟，莢淺綠色，長(zhǎng)圓條形。鄂豇豆7號(hào)（商品名矮虎），短蔓型，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。分枝較多。莖粗壯。節(jié)間長(zhǎng)度中等，早熟，適于爬地栽培；美國(guó)地豆（代號(hào)地豆），短蔓型，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，分枝較多，莖粗壯。節(jié)間短。中熟。以上品種均由湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

各豇豆品種于2014年8月22日播種于江漢大學(xué)湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心基地，按照最適宜密度種植，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。深溝高畦，畦面平整，畦寬1.33m，畦植2行，穴距25cm，每穴2株，小區(qū)面積為6.65m²，以小區(qū)實(shí)際產(chǎn)量折算成667m²產(chǎn)量。按常規(guī)栽培進(jìn)行田間管理。

1.3 供試植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

在現(xiàn)蕾期對(duì)試驗(yàn)材料葉面噴施由海南博士威能農(nóng)用化學(xué)有限公司研制的細(xì)胞分裂素，活性成分為烯腺嘌呤、羥烯腺嘌呤?？傆行С煞趾繛?，004%。以噴等量清水的處理作為對(duì)照。分別于噴施7、14、28、42d后用光譜儀和葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定相關(guān)參數(shù)。

1.4 項(xiàng)目測(cè)定

熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定：采用德國(guó)WALZ生產(chǎn)的多通道連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光儀Monitoring-PAM，于晴天或少云天氣9：00左右，在觀(guān)測(cè)植株群體中挑選有代表性的3片葉片。按照順序進(jìn)行標(biāo)記，暗適應(yīng)15min后測(cè)定激光激發(fā)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測(cè)定3次，取平均值。測(cè)定項(xiàng)目有PAR（X₁）、y（Ⅱ）（X₂）、qL（X₃）、NPQ（X₄）、Y（NO）（X₅）、Y（NPQ）（X₆）、Fo（X₇）、Fm（X₈）、Fv/Fm（X₉）依次代表暗適應(yīng)下的光合有效輻射、光化學(xué)轉(zhuǎn)化能量的比例即PSⅡ?qū)嶋H量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅系數(shù)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)、PSⅡ處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量、PSⅡ處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）、基礎(chǔ)熒光、最大熒光和PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率。

光譜儀參數(shù)的測(cè)定：與葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定同步，采用美國(guó)生產(chǎn)的CI-710植物葉片光譜儀（波段范圍400-1000nm）測(cè)定不同豇豆品種葉片的光譜反射率。在9：00-11：00，測(cè)定時(shí)葉片平放，測(cè)定葉片朝向一致，每次測(cè)定3片葉片，取平均值作為該葉片的反射光譜參數(shù)的測(cè)量值。測(cè)定項(xiàng)目有CRI1（X₁₀）、CNDVI（X₁₁）、NDVI（X₁₂）、WBI（X₁₃）、PRI（X₁₄）、ARI1（X₁₅）、PSRI（X₁₆），計(jì)算公式見(jiàn)表1。

葉綠素含量測(cè)定：鮮葉剪碎，取0.1g放入10mL混合提取液（乙醇：丙酮：水：4.5：4.5：1.0）中。在黑暗環(huán)境下浸泡提取。直至葉片完全變?yōu)榘咨珵橹?，以提取液為?duì)照，取浸提液分別在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定OD_645nm～OD_663nm。葉綠素（a+b）含量單位為mg/g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以葉片葉綠素含量（Y）為試驗(yàn)研究的目的性狀。采用DPS7.05軟件進(jìn)行相關(guān)與回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜、熒光參數(shù)與葉綠素含量相關(guān)性

試驗(yàn)對(duì)PAR（X₁）、Y（Ⅱ）（X₂）、qL（X₃）、NPQ（X₄）、Y（NO）（X₅）、Y（NPQ）（X₆）、Fo（X₇）、Fm（X₈）、Fv/Fm（X₉）、CRI1（X₁₀）、CNDVI（X₁₁）、NDVI（X₁₂）、WBI（X₁₃）、PRI（X₁₄）、ARI1（X₁₅）、PSRI（X₁₆）與葉片葉綠素含量共17個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)分析，分析結(jié)果如表2所示。從表2可以看出。光合有效輻射值PAR與NPQ、Y（NPQ）、Fm差異極顯著，其中Fm的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最大（0.99）；其次是Y（NPQ）和NPQ，相關(guān)系數(shù)分別為-0.84和-0.82。Y（Ⅱ）與Y（NO）差異極顯著，qL與PRI差異顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)，其他指標(biāo)間差異都不顯著。CRH與CNDVI差異顯著，CNDVI與CRI1、PRI差異顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)，與ARI1差異極顯著。呈顯著正相關(guān)。NDVI與PSR1差異極顯著，呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.2 光譜、熒光參數(shù)與葉綠素含量的多元回歸與通徑分析

為進(jìn)一步明確熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)和光譜參數(shù)對(duì)葉綠素含量的直接和間接作用，對(duì)16個(gè)自變量與葉綠素含量進(jìn)行了逐步回歸分析。具體試驗(yàn)以熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)、光譜參數(shù)16個(gè)指標(biāo)為自變量。葉片葉綠素含量為目標(biāo)性狀，進(jìn)行逐步回歸分析，得到回歸方程：

Y=-36.5484+4.0498X₃+25.5160X₄+401.3969X₆+0.0073X₈+77.0011X₁₄+396.2878X₁₅，

該方程的決定系數(shù)為0.9999，剩余通徑系數(shù)為0.0089。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程的方差達(dá)顯著水平（P=0.0167）?；貧w方程中各偏回歸系數(shù)表明，qL每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加4.0498mg/g：NPQ每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加25.5160mg/g；Y（NPQ）每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加401.3969mg/g；Fm每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加0.0073mg/g；PRI每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加77.0011mg/g；ARI1每增加1個(gè)單位，葉綠素含量增加396.2878mg/g。

為進(jìn)一步確定各參數(shù)對(duì)葉綠素含量的影響和作用方式，對(duì)與豇豆葉片葉綠素含量極顯著相關(guān)的6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了通徑分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，6個(gè)顯著指標(biāo)對(duì)葉綠素的直接作用為：Y（NPQ）>ARI1>Fm>PRI>qL>NPO。Y（NPO）和ARI1兩個(gè)自變量對(duì)目標(biāo)性狀具有較大的直接通徑系數(shù)，分別是2.8667和2.0619，說(shuō)明這兩個(gè)自變量對(duì)葉綠素含量的直接正向影響力較高。而qL和NPQ對(duì)葉綠素含量的直接通徑系數(shù)均較小，分別為0.6088和0.1282。在間接通徑系數(shù)中，通過(guò)Y（NPO）的各間接通徑系數(shù)均較大，分別為-1.5775（qL）、2.7134（NPQ）、-2.5252（Fm）、-0.5416（PRI）、-1.1497（4RI1）。此外，NPO通過(guò)Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1的間接通徑系數(shù)大于其直接通徑系數(shù)，說(shuō)明NPO對(duì)葉綠素含量的影響主要是通過(guò)Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1發(fā)生的。PRI通過(guò)ARI1的間接通徑系數(shù)大于其直接通徑系數(shù)，說(shuō)明PRI對(duì)葉綠素含量的影響主要是通過(guò)4RI1發(fā)生的。

2.3 細(xì)胞分裂素處理后葉綠素含量的擬合

在噴施細(xì)胞分裂素28d后，即盛莢期測(cè)定4個(gè)品種豇豆葉片葉綠素含量，并用“2.2”中的葉綠素含量回歸方程擬合葉綠素含量的值，計(jì)算擬合相對(duì)誤差，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，葉綠素?cái)M合的相對(duì)誤差較小，因此可以采用回歸方程快速擬合豇豆葉片葉綠素含量的值。

2.4 豇豆不同成熟度葉片的光譜值

采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)豇豆矮虎不同成熟度葉片的各個(gè)光譜指數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，老葉、幼嫩葉的CRI1與成熟葉的CRI1值差異顯著，老葉與幼嫩葉的CRI1值差異不顯著。3種不同成熟度葉片的CNDVI、WBI、RENDVI值差異極顯著。老葉與成熟葉的NDVI、PRI值差異顯著，其他差異不顯著。3種不同成熟度葉片的ARI1值差異不顯著。PSRI是植被衰老反射率指數(shù)，老葉、成熟葉、幼嫩葉的PSRI指數(shù)差異顯著，老葉的PSRI指數(shù)最高，幼嫩葉的PSRI指數(shù)最低。

3 小結(jié)與討論

植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入到生殖生長(zhǎng)時(shí)，此時(shí)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供需不平衡，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)器官產(chǎn)生早衰現(xiàn)象。葉綠素是植物光合作用的主要色素，含量高低直接決定植物光合作用強(qiáng)度，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響。一般認(rèn)為，葉片中的葉綠素含量較高時(shí)，其光合速率也較高，故可以運(yùn)用葉綠素含量來(lái)評(píng)價(jià)植物的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)狀況。

植物的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)包含大量的光合作用信息，通過(guò)葉綠素?zé)晒饪梢苑从橙~片的光合能力。可以保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受傷害，減少光誘導(dǎo)損傷。PSⅡ的熱耗散增加，F(xiàn)₀降低，PSⅡ反應(yīng)中心的破壞或可逆失活時(shí)F₀增加，可以憑借F₀的變化情況推斷反應(yīng)中心的狀況；F₀大小與葉綠索的含量有關(guān)，F(xiàn)_m大小與OA的氧化還原狀態(tài)有關(guān)，F(xiàn)₀和F_m的下降可能是花青素吸收了葉綠素?zé)晒鈨x的測(cè)量光，降低了葉綠素?zé)晒獾陌l(fā)射強(qiáng)度。光化學(xué)淬滅系數(shù)qL是PSⅡ天線(xiàn)色素吸收的太陽(yáng)光能用于化學(xué)電子傳遞的比例，qL低表明PSⅡ開(kāi)放反應(yīng)中心的比例以及參與CO₂固定的電子減少：Y（NPO）是光保護(hù)的重要指標(biāo)，若調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPO）較高，表明植物獲得的光強(qiáng)過(guò)剩，同時(shí)表明植物仍然能夠通過(guò)調(diào)節(jié)來(lái)保護(hù)自身，比如將過(guò)剩的光能耗散為熱能。NPO是PSⅡ天線(xiàn)色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而耗散掉的部分光能，對(duì)光合機(jī)構(gòu)起一定的保護(hù)作用。

逆境水稻葉片中的F_v/F_m、實(shí)際量子效率（ΦPSⅡ）、qP顯著下降，說(shuō)明PSⅡ反應(yīng)中心受到傷害，而耐性品種可通過(guò)熱耗散耗散掉其過(guò)剩的激發(fā)能，從而保護(hù)光合系統(tǒng)。當(dāng)葉片內(nèi)部葉綠素含量低時(shí)，可能會(huì)造成光化學(xué)反射指數(shù)和光能利用率之間關(guān)系的削弱。外源激素CTK可以阻止葉綠體和光合蛋白的降解，延緩葉片衰老過(guò)程，延長(zhǎng)葉片持綠時(shí)間，延長(zhǎng)葉片的光合作用時(shí)間，能夠提高和延長(zhǎng)植株群體光合速率，從而提高植株產(chǎn)量。本試驗(yàn)中，在盛莢期，除早翠外，葉面噴施細(xì)胞分裂素的柳翠、矮虎、美國(guó)地豆3個(gè)豇豆品種葉綠素含量較噴施等量清水的對(duì)照組高。因此，在盛莢期可以通過(guò)噴施外源細(xì)胞分裂索來(lái)增加葉綠索的含量，從而提供充足的營(yíng)養(yǎng)，

葉綠素能夠吸收紅光和藍(lán)光，以及對(duì)綠光的反射，使植被具有獨(dú)特的光譜特征，為植物光譜指數(shù)估算葉綠素含量提供了可能性。對(duì)始花期大豆葉片光合色素、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光譜指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)光合色素與GNDVI等的相關(guān)性和熒光參數(shù)與PSRI等的相關(guān)性均達(dá)到顯著或極顯著水平，表明大豆葉片葉綠素?zé)晒馓匦耘c其光譜特征指數(shù)之間存在著相關(guān)性。Dauffhtrv等發(fā)現(xiàn)550nm處玉米葉片的光譜反射率與葉綠素含量顯著相關(guān)。PRI對(duì)活體植物的類(lèi)胡蘿卜素變化非常敏感，類(lèi)胡蘿卜素可表征光合作用光的利用率，或碳吸收效率。本試驗(yàn)顯示PRI、ARI1增加時(shí)，葉綠素含量相應(yīng)增加，呈正比關(guān)系。

光照是影響花青索合成的重要因子。李運(yùn)麗等認(rèn)為，葉片在強(qiáng)光條件下可以合成大量的花青素，提高Fv/Fm適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境，葉片在弱光條件下可以抑制花青素的合成來(lái)維持植株的正常生長(zhǎng)。花青素通過(guò)反射和吸收部分太陽(yáng)光，減弱到達(dá)葉綠體的光強(qiáng)。從而保護(hù)葉綠體，減輕光抑制。本試驗(yàn)測(cè)定的葉綠素含量是葉綠素a和b的總量，葉綠素含量與CRI1（類(lèi)胡蘿卜）、PSRI、PRI負(fù)相關(guān)，而與ARI1花青索正相關(guān)。本試驗(yàn)對(duì)豇豆品種矮虎不同成熟度葉片的光譜指數(shù)進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老葉、幼嫩葉與成熟葉的CRI1值差異顯著，CNDVI、WBI、RENDVI值差異極顯著，PSRI指數(shù)差異顯著，ARI1值差異不顯著，說(shuō)明葉片的衰老與光合色素的光譜指數(shù)有一定的相關(guān)性。

逐步回歸分析表明，葉片葉綠素含量是多重因素綜合作用的結(jié)果，各個(gè)因子之間互相聯(lián)系、互相影響。進(jìn)行通徑分析，盡可能地考慮到所有的影響因子，才能取得更為精確的結(jié)果。本試驗(yàn)最終篩選出qL、NPO、Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1共6個(gè)顯著指標(biāo)來(lái)擬合植株葉片葉綠素含量的高低，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中。可以采用一些生產(chǎn)措施例如施肥、噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)提高植株葉片葉綠素含量，從而提高光合速率和產(chǎn)量，其中可以利用豇豆葉片葉綠素?zé)晒馓匦耘c其光譜特征的相關(guān)性，可為利用高光譜遙感技術(shù)對(duì)豇豆光合生理生態(tài)的監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。