無瓣海桑果實(shí)內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抑菌活性

覃媚　李菲　高成?！∮酂挕☆仐澝?/p>

摘要：基于18S rDNA序列分析和GenBank同源性比較，研究采用平板分離法從紅樹無瓣海桑（Sonnera-tia apetala）果實(shí)中分離得到20株內(nèi)生真菌，共18個(gè)屬。分別對(duì)20株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性篩選，其中BGMRC1036T的代謝產(chǎn)物對(duì)荔枝炭疽病菌（Colletotrichumzloeosporioides）有較好的抑制作用，BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC11095T的代謝產(chǎn)物對(duì)番木瓜炭疽病菌有較好的抑制作用，BGM-RCl008T的代謝產(chǎn)物對(duì)香蕉黑星病菌（Cladosporiumcucumerinum）表現(xiàn)出較好抗菌活性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；分離；鑒定；抗菌活性

中圖分類號(hào)：$432.4⁺4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2252-04

內(nèi)生真菌（Endophvte）是指那些在生活史的某一段時(shí)間能夠與健康的宿主組織形成互利共生關(guān)系，而且在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)引起宿主組織發(fā)生病變的真菌。研究表明，幾乎所有植物中都有內(nèi)生真菌的存在，目前已從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)多種具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、殺蟲、免疫抑制、酶抑制劑或激活劑等的活性代謝產(chǎn)物。它們?cè)卺t(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)的生物防治方面都顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值。番木瓜、香蕉和荔枝在生長(zhǎng)過程中容易染上一些病原菌，從而影響外觀、貯藏和年產(chǎn)量。番木瓜炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、香蕉黑星病菌（CladosporiumcucumeFinum）和荔枝炭疽病菌分別是番木瓜、香蕉和荔枝的3種主要病害的病原菌，目前多采用苯并咪唑類和百菌清等化學(xué)藥物進(jìn)行防治。已有研究表明，以上3種病原菌菌株對(duì)苯并咪唑類藥物的抗性由單基因控制，長(zhǎng)期使用易引起基因突變，病原菌抗藥性增強(qiáng)，同時(shí)，化學(xué)抗菌藥物的使用也容易導(dǎo)致不同程度的果品污染及農(nóng)藥殘留超標(biāo)，因此尋找新型殺菌劑日益迫切。

紅樹植物常年處于高溫、高鹽、頻繁潮汐、缺氧、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)紫外線的獨(dú)特環(huán)境中，致使其內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，是許多具有各種活性的先導(dǎo)化合物的重要來源之一。本研究從無瓣海桑（Sonneratia apetala）果實(shí)中分離鑒定其內(nèi)生真菌，并對(duì)其進(jìn)行18S rDNA基因鑒定，以確定其分類學(xué)地位。同時(shí)進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，從中篩選出具有抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌，為新型抗農(nóng)業(yè)病原菌藥物的研究、開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無瓣海桑果實(shí)，采集于廣西欽州茅尾海紅樹林自然保護(hù)區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PAD固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、瓊脂2%、馬鈴薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去離子水配制pH6.5：⑦Trehalose-Aspartc Acid（M4）：L-天冬門酰胺1.0g、海藻糖5.0g、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；③Arginine（M9）：精氨酸1g、甘油6mL、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；④AGG純化培養(yǎng)基：淀粉10g、甘油5mL、葡萄糖1g、復(fù)合鹽溶液10mL、去離子水1000mL、瓊脂粉14g、pH7.2-7.4；⑤PDA液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去離子水配制pH6.5：⑥LB純化培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、pH7.4，去離子水1000mL。

復(fù)合鹽溶液：KNO₃1.000g、NaCl0.500g、MgSO₄·7H₂O0.500g、K₂HPO₄0.500g、NH₄NO₃0.100g、FeSO₄0.010g、MnCl·H₂O0.001g、ZnSO₄·7H₂O0.001g、去離子水100.000mL。

1.1.3 指示菌 番木瓜炭疽病菌、香蕉黑星病菌、荔枝炭疽病菌。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 高壓滅菌器（HVE-50，日本HIRAYAMAHVE公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2112C，上海智城分析儀器制造有限公司）、多功能梯度PCR儀（TGradient，德國(guó)Biometra公司）、電泳儀（TanonEPS-100，上海天能科技有限公司）、冷CCD凝膠成像分析系統(tǒng)暗箱（GelLogic2200Pro，Carestream公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100D-W，日本EYELA公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 取無瓣海桑果實(shí)，用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干水分。無菌條件下對(duì)其表面消毒：次氯酸鈉（含5%有效氯量）浸泡3min→無菌水沖洗3次→75%乙醇浸泡1min→無菌水沖洗3次，并用無菌濾紙吸干表面無菌水。將無瓣海桑果實(shí)切成0.5cm×0.5cm的小塊并進(jìn)行研磨，研磨好的樣品加入1mL無菌水，混勻后，作為10^-1的植物懸液，再依次制成10^-2、10^-3稀釋度的樣液，分別取各梯度稀釋后的樣液0.2mL，分別接種于PDA、M4、M9和AGG4種不同培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)15d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)和菌株分離，同時(shí)做表面消毒效果對(duì)照處理：①將最后1次洗滌無菌水吸取100μL接入培養(yǎng)基中，同等條件下觀察培養(yǎng)。⑦在操作臺(tái)上置1個(gè)始終開蓋的培養(yǎng)皿，同等條件下觀察培養(yǎng)。如果對(duì)照組培養(yǎng)過程中無微生物出現(xiàn)，表明分離得到的菌株是無瓣海桑果實(shí)內(nèi)生菌，而不是表面的附生菌。

1.2.2 菌株的鑒定 分子生物學(xué)鑒定：分別用Chelex100法提取菌株基因組DNA為模板，以真菌通用引物NL1（5'-GCATATCAATA-AGCGCAGGAAAAG-3'）和NI4（5'-GGTCCGT-GTTTCAAGACG-3'）為上下游引物擴(kuò)增菌株的18SrDNA。PCR反應(yīng)體系為（20μL）：無菌水15.6μL，10xBuffer2.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）0.4μL，NL1（10pμmol/L）0.4μL，NI4（10μmol/L）0.4μL，基因組總DNA1μL，LATaaDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸1s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后。72℃延伸維持10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，以Glustalx進(jìn)行多序列比對(duì)后，運(yùn)用MEGA5.0軟件。采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的發(fā)酵及次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用PDA液體培養(yǎng)基。種子液裝入250mL的三角瓶，每瓶加入120mL培養(yǎng)基。121℃滅菌15min。冷卻至室溫。從平板上接入適量菌種，將分離鑒定得到的真菌菌株接入其中，每個(gè)三角瓶接一環(huán)。將已接種的三角瓶移至恒溫培養(yǎng)振蕩器中，150r/min、28℃的搖床上培養(yǎng)7d，將每株真菌菌株分別轉(zhuǎn)接到5個(gè)500mL三角瓶中，每瓶200mL培養(yǎng)基，于150r/min、28℃的搖床上培養(yǎng)7d。發(fā)酵得到培養(yǎng)液用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。并用乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。得到真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。

1.2.4 抗菌活性試驗(yàn) 將分離鑒定后得到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵液分別用DMSO溶液配制成濃度為5mg/mL。再各取5μL溶液添加到濾紙片（直徑6mm）上。然后置于含番木瓜炭疽病菌、荔枝炭疽病菌和香蕉黑星菌的LB培養(yǎng)基檢測(cè)平板上。空白對(duì)照為DMSO溶液，陽性對(duì)照為多菌靈（濃度為5mg/mL）。37℃培養(yǎng)48h。測(cè)量抑菌圉大小。判斷抗菌活性。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。抑菌圈直徑d≥20mm表示具有強(qiáng)抗菌活性：20mm>抑菌圉直徑d≥10mm表示具有中等抗菌活性：10mm>抑菌圉直徑d>6mm表示具有弱抗菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

從無瓣海桑果實(shí)中共分離得到20株內(nèi)生真菌，分別用Chelexl00法提取菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、委托北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其中19株菌的相似性為99%，1株菌的相似性為100%，按照目前通用的真菌分類標(biāo)準(zhǔn)，具有98%～99%序列相似性的菌可以判定為同一個(gè)屬。故研究分離得到的內(nèi)生真菌為18個(gè)屬，分別為4cidiella sp.、Aspergillus sp.、Aureobasidium sp.、Candida sp.、Cladosporium sp.、Mycosphaerella sp.、Graphiola sp.、Basidiomycot sp.、Hypocreaceae sp.、Coniosporium sp.、Meiraargovae sp.、Neopestalotiopsis sp.、Paecilomyces sp.、Penicillium sp.、Pestalotiopsis sp.、Pseudozyma sp.、Sporisorium sp.、Sporobolomyces sp.，結(jié)果如表1所示。以Glustalx進(jìn)行多序列比對(duì)后。運(yùn)用MEGA5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

2.2 內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選

從分離鑒定得到的20株內(nèi)生真菌中，篩選得到4株對(duì)指示菌具有拮抗作用，其中BGMRC1036T的代謝產(chǎn)物對(duì)荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為15.0mm），BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC1095T的代謝產(chǎn)物對(duì)番木瓜炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性（抑菌圈直徑分別為12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代謝產(chǎn)物對(duì)香蕉黑星菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性（抑菌圈直徑為15.0mm）。分離篩選出的4株內(nèi)生真菌對(duì)香蕉黑星病、番木瓜炭疽病和荔枝炭疽病具有較好的拮抗作用，具有作為生物抗菌劑的潛力。

3 小結(jié)與討論

本研究從無瓣海桑果實(shí)中分離得到20株內(nèi)生真菌，通過18SrDNA鑒定，并用BLast軟件在Gen-Bank進(jìn)行同源性比較后確定分離得到的20株內(nèi)生真菌分屬于18個(gè)屬。從種屬數(shù)量可以看出，無瓣海桑果實(shí)內(nèi)生真菌的種屬比較豐富，反映了紅樹內(nèi)生真菌種屬的多樣性，目前已分離得到的紅樹林真菌超過200多種，成為海洋真菌的第二大類群。紅樹植物內(nèi)生真菌生活環(huán)境的特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應(yīng)用潛力。是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。目前，紅樹內(nèi)生真菌主要是從紅樹植物的根際土壤、根、莖、葉幾個(gè)部分分離得到，從紅樹的果實(shí)尤其是具有一定藥效的可食性紅樹果實(shí)中分離鑒定得到的內(nèi)生真菌比較少。

本研究對(duì)分離得到的20株內(nèi)生真菌分別進(jìn)行了抗菌試驗(yàn)，篩選出4株對(duì)香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好拮抗作用的菌株。其中BGM-RC1036T的代謝產(chǎn)物對(duì)荔枝炭疽病菌有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為15.0Him），BGMRC1123T的代謝產(chǎn)物和BGMRC1095T的代謝產(chǎn)物對(duì)番木瓜炭疽病菌表現(xiàn)出較好的抑制作用（抑菌圈直徑分別為12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代謝產(chǎn)物對(duì)香蕉黑星病菌表現(xiàn)出較好抗菌活性（抑菌圈直徑為15.0mm）。研究表明。以上4株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好的拮抗作用，有待于進(jìn)一步分離其抑菌單體，為研究新型抗農(nóng)業(yè)病菌藥物提供寶貴的資源。