高通量測序分析人工養(yǎng)殖成年林麝糞便古菌菌群多樣性

王立志　徐誼英　蔡永華

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014；

2.四川養(yǎng)麝研究所，都江堰611845)

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高通量測序分析人工養(yǎng)殖成年林麝糞便古菌菌群多樣性

王立志1徐誼英1蔡永華2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014；

2.四川養(yǎng)麝研究所，都江堰611845)

摘要：本試驗(yàn)的目的是采用高通量測序技術(shù)研究人工養(yǎng)殖成年林麝糞便中古菌的結(jié)構(gòu)和組成，并對(duì)比不同性別之間的差異。選取12只3歲健康的林麝依據(jù)性別分為雄性組(M組)和雌性組(F組)，每組各6只。采集其新鮮糞便，提取DNA，用古菌通用引物PCR擴(kuò)增古菌16S rRNA的V4～V5區(qū)，用MiSeq 300PE測序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，用QIIME等軟件對(duì)測序序列進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：在從門到屬的各級(jí)分類水平上，F(xiàn)組與M組古菌的相對(duì)豐度差異均不顯著(P>0.05)。M組和F組的組內(nèi)遺傳距離分別為0.16±0.03和0.27±0.06，組間為0.24±0.07，樣品的相似度很高。林麝糞便中的古菌可以分為3個(gè)門，優(yōu)勢門為闊古細(xì)菌門(Euryarchaeota)；在屬水平上可以分為7個(gè)已知屬，優(yōu)勢屬為甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)，其次為熱裸單胞菌屬(Thermogymnomonas)。結(jié)果提示，雄性和雌性林麝糞便中古菌的結(jié)構(gòu)和組成都沒有顯著差異，Methanobrevibacter是林麝糞便中的優(yōu)勢古菌屬

關(guān)鍵詞：林麝；古菌；產(chǎn)甲烷古菌；多樣性

林麝(Moschusberezovskii)屬偶蹄目，麝科，麝屬，是一種珍貴的野生藥用、香料資源動(dòng)物，曾經(jīng)廣泛分布于我國的中部和南部[1]。近年來由于棲息地遭受破壞和過度捕獵，數(shù)量已急劇下降。目前已被國際自然和自然資源保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為瀕危物種(http://www.iucnredlist.org/details/13894/0)。

我國從20世紀(jì)60年代開始人工馴化養(yǎng)殖林麝，至今已有近60年的歷史，但發(fā)展速度很慢。其中一個(gè)主要的原因是人們對(duì)林麝的消化生理知識(shí)了解很少。林麝是草食性反芻動(dòng)物，但其胃腸道微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu)還不為人所知。為了更好保護(hù)和人工馴化養(yǎng)殖，有必要對(duì)林麝胃腸道微生物菌群進(jìn)行系統(tǒng)研究。眾所周知,反芻動(dòng)物瘤胃中棲息著大量微生物，包括細(xì)菌、真菌、原蟲和古菌等。近年來瘤胃產(chǎn)甲烷古菌越來越受到人們的關(guān)注，因?yàn)槿藗兿嘈潘鼈兣c全球越來越嚴(yán)重的溫室效應(yīng)有關(guān)[2]。產(chǎn)甲烷古菌廣泛存在于草食動(dòng)物的胃腸道中，迄今為止，人們已經(jīng)從水牛[3-4]、綿羊[5]、袋鼠[6]、奶牛[7]、犀牛[8]、肉牛[9-10]、駱駝[11]、牦牛[12]等動(dòng)物上分離鑒定出了多種產(chǎn)甲烷古菌。綜合這些研究可以發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物胃腸道產(chǎn)甲烷古菌的多樣性具有宿主特異性。因此作者推測，相對(duì)于其他動(dòng)物而言，林麝腸道古菌的結(jié)構(gòu)和組成可能有很大的差異。而有關(guān)林麝腸道產(chǎn)甲烷古菌的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)的目的就是用高通量測序技術(shù)對(duì)林麝糞便中古菌的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行研究，并對(duì)比不同性別之間的差異。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本次試驗(yàn)動(dòng)物為12只人工養(yǎng)殖的未用過抗生素的健康林麝，根據(jù)其性別分為雄性組(M組)和雌性組(F組)2組，每組各6只(6只雄性林麝編號(hào)為M1、M2、M3、M4、M5、M6；6只雌性林麝編號(hào)為F1、F2、F3、F4、F5、F6)，年齡均為3歲，平均體重為(7.58±1.60) kg，飼養(yǎng)于四川省養(yǎng)麝研究所(中國四川都江堰)。林麝單籠飼養(yǎng)，每天飼喂2次，時(shí)間為08：00和17：00，自由飲水。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，在采樣之前已穩(wěn)定飼喂該飼糧28 d以上。于第29天清晨飼喂前戴上消毒過的無菌一次性手套用干凈竹簽采集動(dòng)物自然排出的糞便并從糞便深處采集，每頭林麝收集新鮮糞便20 g，液氮保存后帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃冰箱，用于提取DNA。

1.2DNA抽提

用TIANamp微生物DNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]提取林麝糞便樣品中微生物總DNA，具體提取步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。用DNA純化試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，然后用原子分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總DNA濃度和純度后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.316S rRNA基因擴(kuò)增及測序

以林麝糞便微生物總DNA為模板，采用古菌通用引物對(duì)：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCAAT-3′)[13]，PCR擴(kuò)增古菌16S rRNA的V4～V5區(qū)。采用50 μL擴(kuò)增體系：上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物5 μL，5 μL的10×Ex Taq buffer(含20 mmol/L Mg2+，TaKaRa公司)，0.25 μL的Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa公司)，1 μL的樣品DNA模板和37.75 μL的milli-Q水。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃，延伸5 min。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)切膠回收古菌PCR產(chǎn)物，并用試劑盒(QIAGEN公司)進(jìn)行純化。純化的PCR產(chǎn)物送Macrogen生物技術(shù)公司(韓國)，用Illumina公司的MiSeq 300PE測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

表1　飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)復(fù)合維生素為每千克飼糧提供 Multi-vitamin provided the following per kg of the diet:VA 3 000 IU，VD 350 IU，VE 30 IU。

2)復(fù)合微量礦物元素為每千克飼糧提供 Multi-mineral provided the following per kg of the diet:Fe (as ferrous sulfate) 30 mg，Cu(as copper sulfate) 10 mg，Zn (as zinc sulfate) 50 mg，Mn (as manganese sulfate) 60 mg。

3)計(jì)算值 Calculated values。

1.4數(shù)據(jù)分析

使用FLASH軟件將測序所得的測序序列(reads)進(jìn)行雙端融合(merge)，最小重疊區(qū)域?yàn)?0 bp，最大重疊區(qū)域?yàn)?20 bp。成功merge的序列，使用QIIME軟件[14]按照條碼(barcode)序列區(qū)分各個(gè)樣品，去除低質(zhì)量序列。標(biāo)準(zhǔn)如下：去除所有含有N的reads；去除含有連續(xù)3個(gè)小于Q20堿基的reads；去除與barcode序列不一致的reads；去除連續(xù)Q20堿基長度小于序列總長75%的reads。將barcode切除掉后，根據(jù)相似性≥97%原則將通過質(zhì)控的有效序列聚類成為運(yùn)算分類單位(operational taxonomic unit，OTU)，并挑選豐度最高的序列作為OTU的代表性序列；使用QIIME軟件將OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫(The Ribosomal Database Project，https://rdp.cme.msu.edu/)進(jìn)行比對(duì)，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)(相似度為0.9)，比對(duì)完畢后使用perl腳本去除所有非古菌OTU。用QIIME軟件剔除嵌合體和Singletons，并在界、門、綱、目、科及屬水平上進(jìn)行物種注釋。采用QIIME默認(rèn)參數(shù)計(jì)算各個(gè)樣品alpha多樣性指數(shù)[Shannon指數(shù)、ChaoⅠ指數(shù)、觀察物種(observed species)指數(shù)]。根據(jù)各個(gè)樣品OTU的種類及其豐度，計(jì)算樣品間的遺傳距離，用非加權(quán)UniFrac距離(unweighted UniFrac distance)表示，根據(jù)計(jì)算結(jié)果采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。利用perl腳本挑選所有樣本中共同存在的共享屬，用R軟件繪制熱圖。2個(gè)處理間數(shù)據(jù)的差異性采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1序列及OTU統(tǒng)計(jì)

將測序得到的雙端序列首先根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成1條序列，經(jīng)過質(zhì)控之后，最終獲得13 130條屬于古菌的有效序列，平均每個(gè)樣品(1 094±164)條?；谙嗨贫却笥?7%基礎(chǔ)上，將獲得的有效序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得720個(gè)屬于古菌的OTU，其中M組385個(gè)[平均值為(80.3±24.5)個(gè)]，F(xiàn)組409個(gè)[平均值為(78.8±27.7)個(gè)]，組間共享OTU為74個(gè)(圖1)。經(jīng)計(jì)算，M組和F組的序列覆蓋度(coverage)分別為80.78%和81.91%。

圖1　雄性林麝組和雌性林麝組糞樣古菌OUT維恩圖

2.2糞便物種組成分析

將獲得的OTU分別從門到屬水平上進(jìn)行物種注釋，具體結(jié)果見表2?？梢钥闯觯敬卧囼?yàn)所得到的90%以上OTU都屬于闊古細(xì)菌門(Euryarchaeota)，而圓齒古細(xì)菌門(Crenarchaeota)和未分類門的相對(duì)豐度較低。2組間在各分類水平上的相對(duì)豐度差異均不顯著(P>0.05)。Crenarchaeota的古菌全部來源于熱變形菌綱(Thermoprotei)，它可進(jìn)一步分為2個(gè)目。其中只有Fervidicoccales可進(jìn)一步分為1個(gè)科和1個(gè)屬。Euryarchaeota由甲烷菌綱(Methanobacteria)、甲烷微菌綱(Methanomicrobia)、熱原體綱(Thermoplasmata)和未分類綱4個(gè)綱組成。其中未分類綱不能進(jìn)一步進(jìn)行分類，其他3個(gè)綱共可分為4個(gè)目、6個(gè)科、7個(gè)屬。Methanobacteria由1個(gè)目、1個(gè)科、3個(gè)屬組成；Methanomicrobia由2個(gè)目、3個(gè)科、3個(gè)屬組成；Thermoplasmata由1個(gè)目、2個(gè)科組成，在科水平上只有未確定的熱源體科(Thermoplasmatales incertae sed)能進(jìn)一步分到屬。在屬水平上，相對(duì)豐度平均值較高的是甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)，其次為熱源體屬(Thermogymnomonas)。雖然在屬水平上2組的差異均不顯著(P>0.05)，但與M組相比，F(xiàn)組Fervidicoccus相對(duì)豐度有降低的趨勢(P=0.10)。

2.3alpha多樣性分析

表3列出了M組和F組樣品的Shannon指數(shù)、ChaoⅠ指數(shù)、observed species指數(shù)。alpha多樣性指數(shù)主要用于評(píng)價(jià)樣品中微生物的豐富性和均勻性?？梢钥闯觯琈組的alpha多樣性指數(shù)在數(shù)值上都大于F組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.4beta多樣性分析

根據(jù)各個(gè)樣品OTU的種類及其豐度計(jì)算了各個(gè)樣品間的遺傳距離，值越小表示樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)越接近，相反，值越大則表示樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)差異越大。M組和F組各自的遺傳距離分別為0.16±0.03和0.27±0.06，2組間遺傳距離為0.24±0.07，基于此，對(duì)樣品進(jìn)行了聚類分析并繪制了PCoA聚類圖(圖2)。可以看出，除了樣品M4和樣品M2外，其他10個(gè)樣品聚集度非常高。雖然F組較M組的聚集程度高，但2組樣品在圖上并沒有依據(jù)其組別而表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集。

表2　林麝糞便在不同分類水平上的古菌組成及其相對(duì)豐度

P<0.05：差異顯著 significant difference；P<0.01：差異極顯著 extremely significant difference。

表3　林麝糞便古菌的alpha多樣性指數(shù)

百分?jǐn)?shù)代表了樣品受主成分影響下的相似性距離

The percentages represented the similarity distance under influence of PC。

圖2林麝糞便古菌PCoA聚類圖

Fig.2PCoA diagram reflecting clustering of

fecal archaea of forest musk deer

2.5共享屬分析

由于F組和M組在古菌的物種組成和豐度，以及alpha多樣性指數(shù)上沒有顯著差異，因此本試驗(yàn)將12個(gè)樣品作為一個(gè)整體，分析了林麝糞便中古菌的共享屬。本試驗(yàn)對(duì)12個(gè)樣品間共享的古菌屬進(jìn)行了分析，并根據(jù)其豐度以熱圖的形式進(jìn)行了展示(圖3)。可以看出，12只林麝之間古菌共享屬主要來源于Euryarchaeota的Methanobacteria和Thermoplasmata這2個(gè)綱。有些共享屬在各個(gè)樣品間的豐度很高，如Methanobrevibacter和Thermogymnomonas，它們的平均相對(duì)豐度分別達(dá)到了樣品古菌總相對(duì)豐度的67%和11%。而有些序列雖然也存在于所有樣品中，但豐度極低，如Euryarchaeota的未分類綱。各個(gè)樣品共享屬的相對(duì)豐度占其古菌總相對(duì)豐度的比例平均在96%以上，這說明在屬水平上，性別對(duì)林麝糞便古菌優(yōu)勢菌群的種類幾乎沒有影響，但同時(shí)應(yīng)該注意到共享屬的豐度在各個(gè)樣品間存在較大差異。

越偏向紅色表示相對(duì)豐度越高，越偏向藍(lán)色表示豐度越低。對(duì)于不能分類到屬水平，但仍然出現(xiàn)在各樣品中的共享序列，用其最高分類水平表示。

The more close to red, the higher the relative abundance, while the more close to blue, the lower the relative abundance. Shared sequences were expressed using the highest classification level, which could not be classified to any genus, but still existed in samples.

圖3樣品間共享屬熱圖

Fig.3Heatmap of shared archaea genera of all samples

3討論

據(jù)了解，本文是第1篇有關(guān)林麝胃腸道古菌的研究報(bào)道。以往有關(guān)動(dòng)物胃腸道古菌的研究，幾乎全部采用的是克隆/測序技術(shù)[3-12]。這種技術(shù)不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且僅能鑒定出樣品中的優(yōu)勢菌群，不能全面反映動(dòng)物胃腸道菌群的結(jié)構(gòu)與組成[15]。高通量測序技術(shù)，是近年來才采用的一種研究微生物生態(tài)學(xué)的全新技術(shù)，它能較全面地鑒定出樣品中微生物的種類[16-17]。在本次研究中，本試驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)在12頭林麝的糞便中，共獲得13 130條屬于古菌的有效序列，檢測到了720個(gè)屬于古菌的OTU，而以往在反芻動(dòng)物瘤胃[3-5,7]、袋鼠前腸[6]、動(dòng)物糞便[8,11]等樣品中，一次試驗(yàn)獲得的古菌序列數(shù)量都在1 000左右，檢測到的OTU個(gè)數(shù)一般都在100個(gè)左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于本次試驗(yàn)結(jié)果。本次試驗(yàn)的OTU經(jīng)行物種注釋后，共分為了3個(gè)門，8個(gè)已知屬。以往在動(dòng)物胃腸道中發(fā)現(xiàn)的古菌幾乎全部都來源于Euryarchaeota，有關(guān)Crenarchaeotea的報(bào)道非常罕見，且一次試驗(yàn)最多僅能檢測到4～5屬的古菌。造成這種差異的原因，應(yīng)該主要?dú)w于試驗(yàn)方法的差異。Kim等[18]綜合分析了NCBI等各種公共數(shù)據(jù)中的古菌序列，并以稀釋曲線為基礎(chǔ)進(jìn)行估測，認(rèn)為瘤胃樣品中屬于古菌的OTU應(yīng)該大于1 400個(gè)，至少需要24 480條測序序列才能全面覆蓋樣品中的古菌。本試驗(yàn)的測序序列數(shù)和OTU數(shù)大概是其1/2，這可能是樣品屬性不同造成的。因?yàn)樵谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，山羊糞便中古菌多樣性顯著低于瘤胃[19]。

以往的研究表明，Methanobrevibacter是單胃動(dòng)物后腸[20-22]和反芻動(dòng)物瘤胃[5,7]的優(yōu)勢古菌。例如，Wright等[5]在對(duì)澳大利亞綿羊瘤胃古菌的研究中就發(fā)現(xiàn)，分析所得的65條古菌序列中，有62條都屬于Methanobrevibacter。在本試驗(yàn)中，在屬水平上，Methanobrevibacter不僅在12個(gè)樣品間是共享屬，而且在雄性、雌性林麝糞便中的相對(duì)豐度分別達(dá)到了71.78%和61.99%，屬于絕對(duì)優(yōu)勢核心屬，這與以往的很多研究結(jié)果是一致的。但也有研究表明，動(dòng)物胃腸道的優(yōu)勢古菌不是甲烷短桿菌，如Sundset等[23]研究發(fā)現(xiàn)，來自馴鹿瘤胃的古菌，53%都屬于未鑒定的古菌。Huang等[12]也發(fā)現(xiàn)，在生存環(huán)境相同且飼喂飼糧一致的條件下，牦牛瘤胃中80.9%的古菌來源于Thermoplasmatales，只有14.9%屬于Methanobacteriales。這說明動(dòng)物胃腸道的古菌在結(jié)構(gòu)和組成上存在宿主特異性，特定動(dòng)物的古菌結(jié)構(gòu)只有通過實(shí)際測定才能確定，而不能根據(jù)以往其他動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推測。

在本試驗(yàn)中，與雄性林麝相比，雌性林麝糞便古菌在從門到屬的各級(jí)分類水平上，相對(duì)豐度都沒有顯著差異。各項(xiàng)alpha多樣性指數(shù)，不同性別間也沒有顯著差異，樣品間的遺傳距離都較小。這些都說明性別對(duì)林麝糞便中古菌的結(jié)構(gòu)和組成沒有顯著影響。以往研究發(fā)現(xiàn)，影響胃腸道古菌的主要因素為品種、飼糧等。例如，Huang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與牦牛相比，黃牛瘤胃中Methanobacteriales(21.5% vs. 12.4%)和Methanomicrobiales(9.8% vs. 1.0%)這2個(gè)目的相對(duì)豐度較高。Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)不同飼料利用效率的肉牛，瘤胃的古菌結(jié)構(gòu)不同，低飼料利用效率組瘤胃古菌多樣性要高于高效率組。Min等[25]報(bào)道，在肉山羊的瘤胃中，Methanobrevibacter的相對(duì)豐度會(huì)隨飼糧濃縮單寧濃度的增加而線性降低。迄今為止，還未見性別對(duì)動(dòng)物胃腸道古菌影響的相關(guān)報(bào)道。作者推測，性別本身可能對(duì)林麝腸道古菌的結(jié)構(gòu)影響就較小，再加上本次試驗(yàn)中，雄性和雌性飼喂的都是同一飼糧，最終體現(xiàn)出組間沒有顯著差異。

4結(jié)論

在從門到屬的各級(jí)分類水平上，雄性和雌性林麝糞便中古菌的結(jié)構(gòu)和組成都沒有顯著差異，Methanobrevibacter是林麝糞便中的優(yōu)勢古菌屬。

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Author, WANG Lizhi, associate professor, E-mail: wanglizhi@aliyun.com

(責(zé)任編輯王智航)

Fecal Archaeal Diversity of Artificial Breeding Adult Forest Musk Deer Analyzed by High-Throughput Sequencing Technologies

WANG Lizhi1XU Yiying1CAI Yonghua2

(1. Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Animal Nutrition Institute of Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China;2. Sichuan Institute of Musk Deer Breeding, Dujiangyan 611845, China)

Abstract:This experiment was conducted to invest the archaeal structure and composition in feces of artificial breeding adult forest musk deer (FMD) using high-throughput sequencing technologies, and to compare the difference between male and female FMD. Twelve healthy FMD with the age of three years were divided into male group (M) and female group (F) according to their gender (6 deer in each group). The fresh feces were collected and DNA was extracted from them. The archaeal universal primers were used to amplify V4 to V5 regions of archaeal 16S rRNA. The amplifications were high-throughput sequenced with the MiSeq 300PE sequencing platform. The QIIME and other softwares were used to analyze the data. The results showed as follows: from phylum to genus levels, the differences of the archaeal relative abundance between group M and group F were not significant (P>0.05). Genetic distance within the samples in group F and group M was 0.16±0.03 and 0.27±0.06, respectively, and that between groups was 0.24±0.07; all samples shared high similarity. The archaea in the feces of FMD can be divided into three phyla, the dominant phylum was Euryarchaeota; on the genus level they can be divided into seven existing genera, the dominant genus was Methanobrevibacter, the next one was Thermogymnomonas. In conclusion, the gender has no significant effect on the archaeal structure and composition in the feces of FMD, and Methanobrevibacter is the dominant genus.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(2)：477-484]

Key words:forest musk deer; archaea; methanogen; diversity

中圖分類號(hào)：S852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)02-0477-08

作者簡介：王立志(1974—)，男，湖北襄陽人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail: wanglizhi@aliyun.com

基金項(xiàng)目：科技部國際合作項(xiàng)目“畜禽低碳養(yǎng)殖關(guān)鍵調(diào)控技術(shù)合作研究”(2014DFA32860)

收稿日期：2015-08-01

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.02.021