亞麻薺FAD2-1和FAD3-1編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

劉寶玲，孫巖，高昌勇，苑麗霞，3，薛金愛，李潤植，張莉*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；

3.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山西 晉中 030600)

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亞麻薺FAD2-1和FAD3-1編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

劉寶玲1，孫巖2，高昌勇1，苑麗霞1，3，薛金愛1，李潤植1，張莉1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；

3.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山西 晉中 030600)

摘要：△-12 脂肪酸脫氫酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15 脂肪酸脫氫酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亞油酸(18∶2；ω-6)和亞麻酸(18∶3；ω-3)合成的限速酶，亦在植物抵御低溫等環(huán)境脅迫反應(yīng)中起重要作用。本文利用生物信息學(xué)工具分析了亞麻薺(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1編碼蛋白的理化性質(zhì)、二硫鍵、磷酸化位點、高級結(jié)構(gòu)、保守域和功能系統(tǒng)進化等特征。結(jié)果表明，F(xiàn)AD2-1和FAD3-1編碼蛋白理論pI相近(分別為8.39和8.42)，然而前者不穩(wěn)定系數(shù)(40.04)顯著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位點為23個，多于FAD3磷酸化位點(18個)，預(yù)示FAD2-1更易受翻譯后調(diào)控。這兩種蛋白均含有3個保守的組氨酸富集區(qū)(Hisbox)，且在C端含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，賦予其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和催化雙鍵形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%)，然而后者無規(guī)則卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D結(jié)構(gòu)模擬顯示，F(xiàn)AD2-1和FAD3-1功能域大小和構(gòu)象存在差異，這可能影響到底物選擇性和催化效率。這些結(jié)果為全面解析亞麻薺種子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子機理提供了科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：亞麻薺；ω-3與ω-6族脂肪酸；脂肪酸脫飽和酶(FAD)；生物信息學(xué)分析

植物油脂是人類飲食的主要脂肪酸營養(yǎng)來源，其脂肪酸組成影響著油脂的品質(zhì)和功能。ω-3族(第一個雙鍵出現(xiàn)在從甲基端數(shù)第三個碳原子處)和ω-6族(第一個雙鍵出現(xiàn)在從甲基端數(shù)第六個碳原子處)不飽和脂肪酸是大豆和油菜等普通油料作物種子油的主要脂肪酸成分，這兩類脂肪酸含量比例決定著植物油脂的營養(yǎng)價值和保健功能。普通油料作物種子油脂肪酸組成是ω-6族含量>ω-3族, 極不利于人類營養(yǎng)和健康。亞麻薺(Camelina sativa)是一種新發(fā)掘的十字花科高油作物(含油量>47%)，種子油中ω-3族脂肪酸顯著高于ω-6族含量，非常適合人類營養(yǎng)和健康需求。因此，基于亞麻薺油的諸多營養(yǎng)保健品研發(fā)近年來日益增多。然而，有關(guān)亞麻薺種子高水平合成積累ω-3族脂肪酸機制還未見報道[1]。

亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)分別是植物油脂中最主要的ω-6族和ω-3族脂肪酸，也是人體自身無法合成的必需脂肪酸[2,3]。催化油酸(18∶1)轉(zhuǎn)化為亞油酸(18∶2)的ω-6脂肪酸脫飽和酶是△-12 脂肪酸脫氫酶(fattyaciddesaturase-2，F(xiàn)AD2)，催化亞油酸(18∶2)轉(zhuǎn)化為亞麻酸(18∶3)的ω-3脂肪酸脫飽和酶是△-15 脂肪酸脫氫酶(fattyaciddesaturase-3，F(xiàn)AD3)。近年來，有關(guān)FAD2和FAD3在多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFA)合成途徑及控制ω-6族和ω-3族脂肪酸比例中的作用備受關(guān)注[4]。此外，F(xiàn)AD2和FAD3也參與了植物低溫等環(huán)境脅迫抗性反應(yīng)。FAD2和FAD3均為膜結(jié)合型脫氫酶,定位于植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面[5]。FAD3主要在組織中催化合成約 80%的三烯脂肪酸。目前，國內(nèi)外學(xué)者已在甘藍型油菜[6,7]、大豆[8]、花生[9]、紅花[10]、棉花[11,12]和煙草[13]等油料作物和藥用植物中成功克隆出FAD2基因，并做了相關(guān)的超表達和沉默表達分析，為油脂合成研究奠定了一定的理論和實驗基礎(chǔ)。FAD3基因的克隆、表達、調(diào)控功能及其家族進化關(guān)系[14]也在相關(guān)文獻中有所報道。

全基因組測序顯示亞麻薺為異源六倍體[1]，在漫長的進化過程中，其染色體基因發(fā)生了復(fù)雜的加倍現(xiàn)象。亞麻薺CsFAD2和CsFAD3基因位于不同染色體不同位置的同源序列各有3個拷貝，且同源性均高達99%[15]。我們先期試驗結(jié)果顯示，CsFAD2-1和CsFAD3-1在發(fā)育種子中高表達，預(yù)示著這兩個ω-6和ω-3脫飽和酶在亞麻薺種子油脂合成和積累中行使重要功能[1]。本文進一步利用生物信息學(xué)方法分析這兩種脫飽和酶的蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等特征及功能差異性，為全面解析亞麻薺種子高水平合成積累ω-3族脂肪酸分子機理，以及后續(xù)定向遺傳改變植物種子油脂肪酸組成提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1亞麻薺脫飽和酶基因鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

從NCBI中的conserved domain database(CDD)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)獲得CsFAD2酶和CsFAD3酶的結(jié)構(gòu)域：二鐵離子結(jié)合位點-組氨酸富集區(qū)[16]。在亞麻薺數(shù)據(jù)庫下載編碼序列(CDS)及其蛋白序列：FAD2-HQ008320.1/ ADU18247.1和FAD3-KJ541074.1/AHZ89305.1，分別命名為FAD2-1和FAD3-1。以隱馬可夫模型在CDD庫中鑒定亞麻薺的FAD2-1和FAD3-1蛋白序列的保守域結(jié)構(gòu)，確定這些基因是準(zhǔn)確的ω-6和ω-3脂肪酸脫飽和酶基因。利用ExPasy網(wǎng)站提供的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白的氨基酸組成、相對分子量、等電點和原子組成等理化性質(zhì)。

1.2亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白序列的一級結(jié)構(gòu)分析

利用DiANNA工具(http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)對亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白序列中二硫鍵的分布進行預(yù)測分析；運用CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/)在線網(wǎng)站分析上述蛋白的葡萄糖-O-糖基化位點和磷酸化位點(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。利用ExPasy網(wǎng)站中的TMHMM工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Protscale網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protscale/ )及Signal P 工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)來分析上述蛋白序列的跨膜區(qū)域、疏水區(qū)域和信號肽區(qū)。

1.3亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白序列的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

通過PBIL LYON-GERLAND數(shù)據(jù)庫(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn. html)對亞麻薺FAD2蛋白序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，采用默認設(shè)置。利用Phyre2網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對上述蛋白采用同源建模法進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，采用Intensive模式。

1.4CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白序列保守域鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

運用MEGA 6.0多序列比對軟件[17]對亞麻薺兩種脫飽和酶和其他物種的10種蛋白序列進行多序列比對，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自舉檢驗值設(shè)置為1000個循環(huán)。利用軟件Genedoc對上述各物種進行多序列比對，從中找出保守域，參數(shù)project/configure/shade level值設(shè)置為no shading。

2結(jié)果與分析

2.1亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1脫飽和酶的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy網(wǎng)站用protparam工具對CsFAD2-1和CsFAD3-1脫飽和酶進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明，二者都由20種氨基酸構(gòu)成，其中CsFAD2-1蛋白中含量最高的氨基酸有Ala、Leu、Tyr ，CsFAD3-1中含量最高的是Val、Leu、Ser。雖然二者所含的Cys、Gln、Met數(shù)量最少，但是CsFAD3-1含量比CsFAD2-1更低。CsFAD2-1和CsFAD3-1分子量分別為44.05和44.24 kD(表1)，與所對應(yīng)的擬南芥脫飽和酶的分子量很接近。理論等電點pI都在8.39以上，CsFAD2-1和CsFAD3-1在280 nm時消光系數(shù)分別為104 335 和 95 020，不穩(wěn)定系數(shù)分別是40.04、29.46，顯然CsFAD2-1蛋白不穩(wěn)定，而CsFAD3-1為穩(wěn)定蛋白。CsFAD2-1和CsFAD3-1的脂肪系數(shù)是84.84和88.43，總的平均親水性為-0.072和-0.106，說明這些蛋白親水性很差，屬于疏水性蛋白。

表1亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白理化性質(zhì)分析

Table 1Physical and chemical properties of CsFAD2-1 and CsFAD3-1 protein analysis inCamelinasativa

2.2亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1脫飽和酶的一級結(jié)構(gòu)分析

2.2.1CsFAD2-1和CsFAD3-1脫飽和酶的二硫鍵分析

對亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1進行二硫鍵分析，結(jié)果顯示，CsFAD2-1蛋白序列可能形成5個二硫鍵，分值最高的是第209～363位，為0.997 27，在第7號α螺旋和10號α螺旋之間形成二硫鍵(α7-α10)，與擬南芥AtFAD2的二硫鍵預(yù)測結(jié)果很接近(表2)。而CsFAD3-1的二硫鍵較CsFAD2-1和AtFAD3得分率低，推測其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中彎曲折疊程度低于其他蛋白，能夠更好地結(jié)合底物，發(fā)揮其催化作用。

2.2.2CsFAD2-1和CsFAD3-1糖基化位點和磷酸化位點分析

預(yù)測發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白并沒有葡萄糖-O-糖基化位點，CsFAD2-1絲氨酸激酶(Ser)和酪氨酸激酶(Thr)磷酸化位點數(shù)(12個、10個)比CsFAD3-1(11個、4個)多(表3),分別在N端和C端分布比較密集，而后者分布較疏散(圖1)。蘇氨酸激酶磷酸化位點數(shù)(1個)則少于CsFAD3-1(3個)，且該磷酸化位點得分均低于上述兩種，推測其在蘇氨酸處磷酸化的可能性較低。另外，CsFAD3-1的總磷酸化位點數(shù)(18個)明顯高于擬南芥AtFAD3(8)，有可能CsFAD3-1在催化亞油酸合成亞麻酸的過程中，更能被上述三種激酶磷酸化，從而更好地發(fā)揮催化功能。

表2　亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1的二硫鍵分析

表3CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白磷酸化位點分析

Table 3Phosphorylation sites analysis of CsFAD2-1 and CsFAD3-1 inCamelinasativa

基因名稱Proteinname磷酸化位點數(shù)Phosphorylationsitenumbers最高得分及位置HighestscoreandlocationSer12第17位:0.998CsFAD2-1Thr123第33位:0.648Tyr10第365位:0.979Ser11第16位:0.998AtFAD2Thr224第21位:0.980Tyr11第364位:0.979Ser11第170位:0.996CsFAD3-1Thr318第220位:0.769Tyr4第362位:0.985Ser5第167位:0.996AtFAD3Thr18第217位:0.769Tyr2第281位:0.871

2.2.3CsFAD2-1和CsFAD3-1的跨膜區(qū)和疏水性分析

利用TMHMM工具對CsFAD2-1以及CsFAD3-1蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖2a,圖2b分別表示亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白的跨膜螺旋;圖2c,圖2d分別表示擬南芥FAD2和FAD3蛋白的跨膜螺旋)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsFAD2-1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上由外到內(nèi)有5個跨膜區(qū)，其對應(yīng)的跨膜位置為o55-77i84-106o116-138i175-197o248-270i(如圖2a，“o”代表膜外，“i”代表膜內(nèi))，而由CsFAD3-1蛋白則由膜內(nèi)到膜外有3個跨膜螺旋區(qū)，其對應(yīng)的跨膜位置為i64-86o112-134i221-248o(如圖2b)。CsFAD2-1比擬南芥AtFAD2(如圖2c)的跨膜區(qū)數(shù)目少一個，形成的跨膜區(qū)位置極為相似，有可能在發(fā)揮催化作用時，可能在十字花科植物中具有類似的代謝通路。而CsFAD3-1則與擬南芥AtFAD3-1(如圖2d)相比，其跨膜區(qū)數(shù)目較少，有相似的部分跨膜區(qū)位置，推測其催化亞麻酸合成過程中，不同的結(jié)構(gòu)有可能參與其他的生化代謝途徑。采用Protscale網(wǎng)站和SignalP網(wǎng)站分析CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白的疏水性和信號肽區(qū)。有跨膜的區(qū)域，疏水性較高，其本身作為一種膜結(jié)合蛋白，因而是疏水蛋白。經(jīng)信號肽檢測，這兩種蛋白都沒有信號肽和酶切位點，說明這兩種蛋白光定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并不跨膜分泌到其他位置。

2.3亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1脫飽和酶的高級結(jié)構(gòu)分析

通過PBIL LYON-GERLAND網(wǎng)站對CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(如圖3)，這些蛋白僅含有三種結(jié)構(gòu)，分別為α螺旋、β片層和無規(guī)則卷曲，占據(jù)不同的比例。CsFAD2-1蛋白α螺旋、β片層和無規(guī)則卷曲占的比例分別為：45.31%、10.16%和44.53%，與AtFAD2的結(jié)構(gòu)比例相差不多。而CsFAD3-1所含的比例分別為：33.16%、14.91%和51.93%。其螺旋數(shù)較少，β片層和無規(guī)則卷曲卻比CsFAD2-1蛋白多。這與上述的跨膜區(qū)和疏水區(qū)預(yù)測結(jié)果是一致的。用同源建模的方法來預(yù)測這兩種蛋白的三級結(jié)構(gòu)(如圖4)，CsFAD2-1預(yù)測的氨基酸范圍達到65%，估測率為99.9%，而CsFAD3-1的估測率大于90%時，氨基酸范圍為75%，很明顯其不規(guī)則卷曲程度較高。

圖1　亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白磷酸化位點分布圖Fig.1　Phosphorylation sites analysis of CsFAD2-1 and CsFAD3-1 in Camelina sativa

圖2　亞麻薺脫飽和酶CsFAD2-1和CsFAD3-1的蛋白跨膜螺旋分析　(a,b分別表示亞麻薺FAD2-1和FAD3-1蛋白的跨膜螺旋;c,d分別表示擬南芥FAD2和FAD3蛋白的跨膜螺旋)Fig.2　The transmembrane helix antenna analysis of desaturase CsFAD2-1 and CsFAD3-1 in Camelina sativa　(a,b, present the transmembrane helical of FAD3-1 and FAD2-1 protein in Camelina sativa; c, d, present the transmembrane helical of FAD2 and FAD3 protein in Arabidopsis thaliana)

圖3　亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(藍色線：α螺旋，粉色線：無規(guī)則卷曲，紅色線：β片層)Fig.3　The second structure prediction of CsFAD2-1 and CsFAD3-1 in Camelina sativa (Blue line：αhelix, pink line ：random coil, red line：βsheet)

圖4　亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(紅色：肽鏈N端，藍色：肽鏈C端)Fig.4　The third structure prediction of CsFAD2-1 and CsFAD3-1 in Camelina sativa (Red： N terminal of peptide, blue ：C terminal of peptide)

2.4保守域及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用GeneDoc軟件對各物種FAD2和FAD3蛋白序列進行多序列比對，從中找到亞麻薺的組氨酸保守域及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(圖5)。發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsFAD2-1、CsFAD3-1及其同源序列也具有其他物種ω-6和ω-3脂肪酸脫飽和酶所具有的3個組氨酸富集區(qū)，即Hisbox I、Hisbox II和Hisbox III。ω-6脂肪酸脫飽和酶組氨酸保守區(qū)分別為：HECGHH、PYFSWKYSHRRHH和HNITDTHVAHX，而ω-3脂肪酸脫飽和酶的為：HDCGHG、HGWRSHRTHH和HHDIGTHVIHH，保守區(qū)的組成有所不同，但是都能各自形成酶活性催化中心及其鐵原子結(jié)合部位。通過分析，也發(fā)現(xiàn)了這些蛋白都在C端不同程度存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KKXX-like motif (圖5，且因FAD2和FAD3基因不同，滯留信號數(shù)量有所差別。從中也發(fā)現(xiàn)了亞麻薺CsFAD2-1的KKXX-like motif與其他物種沒有太大差別，而CsFAD3-1及其同源序列擁有特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，如KKKGE、KKDH(圖5陰影)，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的滯留方式可能與其他物種的相應(yīng)蛋白不同，其數(shù)目少于CsFAD2-1，與跨膜數(shù)、疏水性和螺旋數(shù)都是一致的，推測其結(jié)合區(qū)較少，裸露在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的部分較多，可能和底物結(jié)合更加緊密，催化反應(yīng)比ω-6脂肪酸脫飽和酶效率更高?？梢杂肕EGA 6.0軟件對不同物種脫飽和脂肪酸脫氫酶(表4)進行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖6)。從中可以得出，進化樹可以分為FAD2和FAD3兩大分支，說明ω-6脫飽和酶基因和ω-3脂肪酸脫飽和酶基因編碼的蛋白序列還是有較大差別的，而在各個分支中十字花科的物種FAD蛋白均聚類在一起，如亞麻薺、甘藍型油菜、芥菜和擬南芥。

表4不同物種FAD蛋白序列信息

Table 4The information of different species FAD protein sequence

Genbank登錄號Genbankaccession物種Species拉丁文名Latinname蛋白簡稱ProteinacronymADU18247.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD2-1ADU18248.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD2-2ADU18249.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD2-3NP_187819.1擬南芥ArabidopsisthalianaATFAD2XP_008443062.1甜瓜CucumismeloCmFAD2ACF49507.1亞麻LinumusitatissimumLuFAD2AAL37484.1陸地棉GossypiumhirsutumGhFAD2XP_003625259.1蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaMtFAD2ADJ58018.1甘藍型芥菜BrassicanigraBniFAD2ACP39505.1甘藍型油菜BrassicanapusBnaFAD2AHZ89305.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD3-1AHZ89306.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD3-2AHZ89307.1亞麻薺CamelinasativaCsFAD3-3AEC08331.1擬南芥ArabidopsisthalianaAtFAD3NP_001236943.1大豆GlycinemaxGmFAD3ADP07952.1棉豆PhaseoluslunatusPlFAD3NP_001292929.1麻瘋樹JatrophacurcasJcFAD3AIY68469.1陸地棉GossypiumhirsutumGhFAD3XP_002298309.1毛白楊PopulustrichocarpaPtFAD3XP_004294292.1草莓FragariavescaFvFAD3

圖6　各物種FAD2和FAD3蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　The phylogenetic tree of FAD2 and FAD3 proteins of different species

3討論

本文分別以擬南芥AtFAD2和AtFAD3為參照，對亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白序列進行了較為全面的生物信息學(xué)分析。從理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、疏水區(qū)、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)亞麻薺這兩種脂肪酸脫飽和酶蛋白疏水性較高，在跨膜區(qū)有明顯的疏水性質(zhì)。CsFAD2-1的二級結(jié)構(gòu)α螺旋比CsFAD3-1多，且分布更為密集，這一特征也體現(xiàn)在三級結(jié)構(gòu)中。與其他ω-6和ω-3脂肪酸脫飽和酶相似[18]，本研究發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1也屬于膜結(jié)合蛋白,其蛋白序列3個組氨酸富集框基本一樣。這些保守域在空間結(jié)構(gòu)上形成了酶的催化活性中心,以及所必需的鐵原子結(jié)合位點。 FAD2-1蛋白C端都有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KKXX-like motif[14]。亞麻薺FAD3-1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的滯留信號比其他物種明顯，自身還擁有特異性賴氨酸保守區(qū)，可以與膜上鑲嵌的蛋白氨基酸形成共價鍵從而錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其錨定方式與其他物種有所差別。這種錨定方式的差異可能有利于催化更多的亞油酸(ω-6)轉(zhuǎn)化為亞麻酸(ω-3)。

一些研究依據(jù)功能分析認為[19]，F(xiàn)AD3是從FAD2進化而來。我們對CsFAD2-1和CsFAD3-1結(jié)構(gòu)分析亦顯示這種進化路徑， 即先出現(xiàn)FAD2催化油酸(18∶1)合成一個雙鍵而生成亞油酸(18∶2), 接著 FAD3催化亞油酸(18∶2)再產(chǎn)生一個雙鍵而合成亞麻酸(18∶3)。CsFAD2-1和CsFAD3-1蛋白組氨酸富集區(qū)的不同位置，而不同位置的組氨酸富集區(qū)對酶空間構(gòu)象和功能域起著決定性的作用，則說明這兩種酶雖然都催化碳碳單鍵合成碳碳雙鍵，但因其底物特異性，有可能將同一種碳碳單鍵形成順式或者反式雙鍵[20]，在功能分化方面有著較大差異，這與Cahoon等[21～23]的報道一致，脫飽和酶的功能分化可能與底物結(jié)合的空間構(gòu)象有關(guān)。

總之，本文對亞麻薺CsFAD2-1和CsFAD3-1的生物信息學(xué)分析進一步表明CsFAD2-1和CsFAD3-1在亞麻薺種子油脂合成起重要作用。亞油酸易氧化，營養(yǎng)價值低。然而，油酸與之相反，是一類健康有益型脂肪酸。未來可采用RNAi等技術(shù)沉默CsFAD2-1，減少亞油酸生成，使油酸大量積累，培育富含油酸的亞麻薺專用種質(zhì)。也可通過遺傳修飾上調(diào)CsFAD3-1表達和酶活性，不僅促使亞麻酸(ω-3)富集，而且有利于增加其他長鏈ω-3族脂肪酸(如，二十碳五烯酸，EPA和二十二碳六烯酸DHA)的合成積累，培育獲得具有更高保健功效的特用油脂品種。進一步研究需闡明亞麻薺這兩個脫飽和酶的精細表達調(diào)控機制。

參考文獻

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(編輯：邢國芳)

Bioinformatics analysis of FAD2-1 and FAD3-1 coding proteins inCamelinaSativa

LiuBaoling1,SunYan2,GaoChangyong1,YuanLixia1，3,XueJinai1,LiRunzhi1,ZhangLi1*

(1.Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2.College of Life Science,Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 3.College of Biological Science and Technology, Jinzhong University, Jinzhong 030600, China)

Abstract:FAD2(fatty acid desaturase 2) and FAD3 (fatty acid desaturase 3) are the rate-limiting enzymes responsible for linoleic acid (18∶2; ω-6) and α-linolenic acid (18∶3; ω-3) synthesis pathway, and also function importantly in plant responses against cold and other environmental stresses. In the present study, bioinformatics tools were employed to characterize CsFAD2-1 and CsFAD3-1 proteins in Camelina sativa, including physicochemical properties, disulfide, phosphorylation sites, advanced 3D structure, and evolutionary conserved domain. It was shown that the theoretical pI values of CsFAD2-1(8.39) and CsFAD3-1 (8.42) proteins were similar, while the former had higher instability coefficient (40.04) than the later (29.46). CsFAD2-1 contained 23 phosphorylation sites more than CsFAD3-1’s (18 sites), indicating CsFAD2-1 was more possibly affected by post-translational regulation. Both proteins shared three highly conserved histidine rich motifs (Hisbox), with endoplasmic reticulum (ER) retention signal at the C-terminus, offering their locations in ER and calalytic activities for double-bond formation. There were moreɑ-helix in CsFAD2-1 (45.31%) than in CsFAD3-1(33.16%) while more random coils exited in CsFAD3-1 (51.93%) than in CsFAD2-1 (44.53%). 3D structure simulation revealed that there were differences in functional domain size and confirmation for both proteins, suggesting the two proteins have different substrate selectivity and enzymatic activity. All these results provide a scientific reference for understanding the molecular mechanism underlying lipid biosynthesis and ω-3 fatty acid high accumulation in camelina seeds.

Key words:Camelina sativa; ω-3 and ω-6 fatty acids； Fatty acid desaturase (FAD)； Bioinformatics analysis

中圖分類號：S565.9

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)04-0242-09

基金項目：國家自然基金(31401430和31501323)，山西省自然科學(xué)基金(2013021024-1)

作者簡介：劉寶玲(1988-)，女(漢)，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳與基因工程*通訊作者：張莉，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel:15835431430，E-mail:zhangli7912@163.com

收稿日期：2015-12-28修回日期：2016-02-02