不同灸法對(duì)免疫抑制兔T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的影響

單增天，吳愛(ài)花，田岳鳳，李雷勇，王 軍

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原030001）

實(shí)Expe驗(yàn)rim en中tal S醫(yī)tudy藥 on T學(xué)CM

不同灸法對(duì)免疫抑制兔T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的影響

單增天1，吳愛(ài)花1，田岳鳳1，李雷勇2，王 軍1

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西太原030001）

“實(shí)驗(yàn)”雖然是現(xiàn)代科學(xué)研究常用的方法，然在我國(guó)卻自古有之。古代學(xué)者王沖說(shuō)“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實(shí)驗(yàn)也”，顏之推說(shuō)“昔在江南，不信有千人帳，及來(lái)河北，不信有二萬(wàn)斛船，皆實(shí)驗(yàn)也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學(xué)意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)并非只是經(jīng)驗(yàn)之學(xué)，而更充滿實(shí)驗(yàn)的思想和方法。實(shí)驗(yàn)中醫(yī)藥學(xué)，將現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)科學(xué)的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法融合起來(lái)，開(kāi)拓現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的新領(lǐng)域。

目的：觀察不同灸法對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的影響。方法：將大耳白兔50只隨機(jī)分成5組，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組、假藥餅灸組。除空白組外，其他4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)造模7 d，造成免疫抑制模型。3個(gè)治療組分別給予隔藥餅灸、艾灸、假藥餅灸治療，隔日灸，共灸10次。治療結(jié)束次日靜脈取血，ELISA法檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞值。結(jié)果：與空白組比較，模型組CD3+明顯降低、CD8+明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，隔藥餅灸組CD3+升高、CD8+降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；艾灸組和假藥餅組CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞及B細(xì)胞值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：隔藥餅灸能有效地調(diào)節(jié)因環(huán)磷酰胺所致的CD3+下降、CD8+升高。

環(huán)磷酰胺；免疫抑制；隔藥餅灸；T細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞；B細(xì)胞

艾灸在我國(guó)已有兩千多年的歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要部分。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)艾灸能夠有效地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，使處于免疫抑制狀態(tài)的機(jī)體恢復(fù)正常狀態(tài)。隔藥餅灸是將藥物、艾灸、穴位三者有機(jī)結(jié)合作用于機(jī)體，本文從這一角度研究隔藥餅灸對(duì)免疫抑制兔機(jī)體T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的影響，并與艾灸組及假藥餅組相比較，為艾灸提高機(jī)體免疫力低下提供明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只大耳白兔來(lái)自北京昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0010］，體質(zhì)量（2.5±0.3）kg，雌雄不限。飼養(yǎng)溫度和濕度分別為20℃～25℃、50%～70%。

1.1.2 藥物與試劑 清艾條：江蘇盱眙華佗中藥廠（批號(hào)：Z32020153）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：200mg/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：H14023686）；0.9%NaCl注射液500mL：石家莊四藥有限公司。酶聯(lián)免疫試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模 將50只大耳白兔隨機(jī)分為5個(gè)組，每組10只，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組。造模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，除空白組外其余4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg（環(huán)磷酰胺用0.9%NaCl注射液稀釋），每天上午注射給藥，連續(xù)7 d，制造免疫抑制模型，空白組注射等量0.9%NaCl注射液。

1.2.2 穴位選擇 神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）。穴位定位參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［1］常用動(dòng)物穴位定位法及擬人比照法。

1.2.3 藥物制作 按六味地黃丸組方劑量將熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓打碎成粉末，過(guò)120目篩備用，用75%酒精將藥物粉末調(diào)勻制作藥餅，藥餅均用模具制成，直徑1 cm，厚0.3 cm；假藥餅原料采用面粉，制作方法與藥餅相同。

1.2.4 施灸方法 施灸前將動(dòng)物穴位處皮毛剪去，將其固定于兔臺(tái)。將江蘇盱眙華佗中藥廠的清艾條折斷，取出艾絨，制成大小相等，底徑0.8 cm、高0.5 cm的圓錐形艾柱，置于藥餅和假藥餅上，以線香點(diǎn)燃，燃盡更換，每穴連灸3壯，隔日灸，共灸10次；艾灸組將3壯艾柱量的艾絨制作成小艾條，置于穴位上施灸。隔日灸，共灸10次。

1.3 樣品采集及指標(biāo)觀察

治療結(jié)束次日，動(dòng)物麻醉，取腹腔靜脈血，離心，抽取血清備用。ELISA法檢測(cè)：CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

與空白組比較，模型組、假藥餅組CD3+明顯降低、CD8+明顯升高，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CD4+、NK、B細(xì)胞3項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組CD3+升高、CD8+降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

環(huán)磷酰胺可殺傷淋巴細(xì)胞，尤其對(duì)早期NK細(xì)胞有明顯抑制作用；T、B細(xì)胞是重要的淋巴細(xì)胞，對(duì)環(huán)磷酰胺也最為敏感，可抑制T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，抑制B細(xì)胞的特異性抗體反應(yīng)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，環(huán)磷酰胺是一種常用的免疫抑制劑，對(duì)動(dòng)物機(jī)體可產(chǎn)生中等至嚴(yán)重的免疫抑制作用，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，造成免疫功能的低下［2-3］。因此，在實(shí)驗(yàn)研究中常利用這一作用制作免疫抑制模型。環(huán)磷酰胺是一種強(qiáng)免疫抑制劑，主要免疫抑制機(jī)制為：可殺傷淋巴細(xì)胞，尤其早期對(duì)B細(xì)胞、NK細(xì)胞作用明顯；抑制T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原刺激后的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化；抑制B細(xì)胞的特異性抗體反應(yīng)［4］。CD3+、CD8+、NK細(xì)胞等都是免疫細(xì)胞中重要的檢測(cè)指標(biāo)。T淋巴細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，CD3+是成熟T細(xì)胞的表面標(biāo)志，其數(shù)量代表細(xì)胞免疫的總體水平；CD4+主要表達(dá)于輔助T細(xì)胞，CD8+表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞上，二者對(duì)免疫功能的判斷有重要作用。NK細(xì)胞是機(jī)體重要的一類免疫細(xì)胞，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和自身免疫性疾病。B細(xì)胞是體內(nèi)唯一能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，外周血B細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%～20%，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮體液免疫功能。

表1 不同灸法對(duì)免疫抑制兔血清CD、NK及B的影響 （±s）

表1 不同灸法對(duì)免疫抑制兔血清CD、NK及B的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與空白組比較，2）P＜0.01

組別 n CD3+（U/ml）CD4+（U/ml）CD8+（U/ml）NK（nmol/L） Bc（ng/L）空白組 10 42.48±4.52 23.61±0.90 8.94±1.47 84.79±10.64 587.00±117.81模型組 10 32.00±8.322）23.37±2.25 10.76±1.082）92.21±10.60 632.67±140.81隔藥餅組 10 42.73±4.721）23.76±1.53 9.01±0.661）91.47±16.21 647.00±108.07艾灸組 10 39.79±5.40 23.70±3.16 9.67±1.51 91.76±21.84 704.59±213.95假藥餅組 10 32.48±11.772）24.49±2.23 10.52±1.332）88.16±10.04 660.19±149.20 F值 4.80 0.36 4.31 0.47 0.77 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

神闕與關(guān)元均為任脈上穴位，神闕穴可健脾和胃、強(qiáng)壯保健、祛病延年，關(guān)元穴培補(bǔ)元?dú)?；足三里為足?yáng)明胃經(jīng)之合穴，根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“合治內(nèi)腑”的理論，凡六腑之病皆可用之，具有理脾胃、調(diào)氣血、補(bǔ)虛損之功效，灸足三里，可強(qiáng)身健體，延緩衰老；脾俞、腎俞為脾腎兩臟之背俞穴，氣血匯聚于此，長(zhǎng)灸之可健脾益氣、滋陰補(bǔ)腎。研究表明，艾灸足三里穴、關(guān)元穴通過(guò)增加NK、NKT細(xì)胞數(shù)量，改善訓(xùn)練小鼠的細(xì)胞免疫功能［5］。早期研究發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸健康老年人大椎等穴，發(fā)現(xiàn)艾灸組T細(xì)胞亞群比例得到調(diào)整，CD3+、CD4+百分率增高，CD4+/CD8+比率也隨之升高，治療前后差異有顯著意義［6］。艾灸督脈穴可延緩胸腺和脾臟的萎縮和退化，糾正T細(xì)胞亞群比例失衡的狀態(tài)［7］。

六味地黃丸為滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方，方中重用熟地黃為君藥，滋陰補(bǔ)腎、填精益髓，有大補(bǔ)真陰之功效；用補(bǔ)肝養(yǎng)腎而澀精的山萸肉和健脾固腎而固精的山藥為臣藥，三味補(bǔ)藥相配伍有滋腎、養(yǎng)肝、益脾的作用；佐以澤瀉利水滲濕、瀉腎火，防熟地之滋膩戀邪；丹皮清瀉相火，涼肝而瀉陰中伏火，制山萸肉之溫澀；茯苓滲濕健脾，既助山藥補(bǔ)脾，又助澤瀉利水，且防熟地滋膩有礙脾胃運(yùn)化。六味地黃丸是中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的代表方，臨床既可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，又可抑制免疫反應(yīng)［8］。六味地黃湯對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)具有調(diào)節(jié)和恢復(fù)平衡的作用，從湯劑中逐步分離獲得免疫活性部位CA4，再分離純化得到CA4-3，其是免疫活性多糖，B細(xì)胞是其直接作用的主要靶細(xì)胞之一，表明六味地黃湯中的酸性多糖是該復(fù)方發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一［9］。六味地黃軟膠囊可改善環(huán)磷酰胺致成年及幼年小鼠免疫功能低下，表現(xiàn)在改善T細(xì)胞增殖能力，提高T細(xì)胞數(shù)量，尤其是CD8+細(xì)胞，明顯提高脾細(xì)胞天然殺傷活性，能明顯降低遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。說(shuō)明六味地黃軟膠囊能增強(qiáng)機(jī)體的防御功能，抵御外邪入侵［10］。藥理研究證實(shí)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的功能，從而改善機(jī)體免疫功能［11］。

隔藥餅灸是臨床常用灸法之一，是將中藥與艾灸有機(jī)結(jié)合的一種方法，具有艾灸、藥物、腧穴三重效應(yīng)，通過(guò)艾灸的溫?zé)嶙饔么龠M(jìn)皮膚對(duì)滋陰補(bǔ)腎藥物的吸收，經(jīng)經(jīng)絡(luò)傳輸從而發(fā)揮藥物歸經(jīng)之效能。我們十余年的臨床研究結(jié)果充分表明隔藥餅灸對(duì)機(jī)體免疫功能的良好調(diào)節(jié)作用［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后CD3+明顯低于空白組、CD8+明顯高于空白組（P＜0.01），表明腹腔注射環(huán)磷酰胺造模成功。隔藥餅灸神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）后，免疫抑制兔血清中CD3+含量明顯回升，CD8+含量明顯降低，表明隔藥餅灸通過(guò)調(diào)節(jié)CD3+、CD8+含量達(dá)到提高免疫抑制兔的免疫功能。艾灸組、假藥餅灸組與模型組比較各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明艾灸組、假藥餅灸治療效果不佳。然而不同灸法對(duì)CD4+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞3項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯影響，同時(shí)，艾灸組的變化也不明顯，出現(xiàn)這一問(wèn)題是與艾灸量有關(guān)？還是樣本含量不夠大？這將是我們下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

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（編輯：張世霞）

Effect of differentmoxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits

Shan Zengtian1，Wu Aihua1，Tian Yuefeng1，Li Leiyong2，Wang Jun1
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi030001）

Objective：To observe the effect of different moxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits induced by cyclophosphamide.Methods：50 rabbits were random ly divided into blank group，model group，cake-separated moxibustion group，moxibustion group，counterfeitmoxibustion group with 10 in each group.In addition to the blank group，the other groupswere injected with cyclophosphamide（60mg/kg）for sequential 7 days tomake immunosuppression model.Cake-separated moxibustion group，moxibustion group and counterfeitmoxibustion group were given moxibustion 10 times respectively once every other day.Venous blood was taken from the next day after treatment and CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells of serum were tested by ELISA.Results：Compared with blank group，CD3+was significantly decreased（P＜0.01）and CD8+was apparently increased（P＜0.01）in model group.Compared with model group，CD3+was significantly increased（P＜0.01）and CD8+was apparently decreased（P＜0.01）.in cake-separated moxibustion group the difference in CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells betweenmoxibustion group and counterfeitmoxibustion group was not statistical significance.Conclusions：Cake-separated moxibustion can effectively regulate CD3+，CD8+level induced by cyclophosphamide.

cyclophosphamide；immunosuppression；cake-separated moxibustion；T cell subsets；NK cells；B cells

R285

A

1671-0258（2016）01-0016-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373742）

單增天，在讀碩士，E-mail：m13233639635_1@163.com

田岳鳳，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：tyfsx@163.com