新疆南疆核桃樹腐爛病菌鑒定

郭開發(fā)，王 剛，吳彩蘭，包亞洲，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子　832003)

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新疆南疆核桃樹腐爛病菌鑒定

郭開發(fā)，王 剛，吳彩蘭，包亞洲，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子832003)

摘要：【目的】 明確新疆南疆核桃腐爛病菌種類。【方法】從南疆3個地方采集核桃腐爛病樣10份，采用組織分離法分離獲得10個分離物，根據(jù)科赫氏法則進(jìn)行致病性測定，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和18 S rDNA-ITS、β-tubulin兩個基因序列分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)形態(tài)學(xué)特征鑒定，菌落形態(tài)、分生孢子器、分生孢子與已報道的金黃殼囊孢 Cytospora chrysosperma 一致；從18 S rDNA-ITS、β-tubulin 兩個基因序列分析可以得出，18 S rDNA-ITS 序列分析結(jié)果與 C.chrysosperma (登錄號：KP114125.1)相似性為 99%,β-tubulin序列分析結(jié)果與 C.chrysosperma (登錄號：KP117038.1) 相似性達(dá)到 98%。【結(jié)論】新疆南疆核桃樹腐爛病菌為金黃殼囊孢 C. chrysosperma。

關(guān)鍵詞：核桃；腐爛??；鑒定；金黃殼囊孢

0引 言

【研究意義】核桃(Juglansregia L.)是胡桃科核桃屬的重要經(jīng)濟(jì)樹種，是世界四大干果之一，具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值[1,2]。目前，新疆核桃種植面積約為 28×104hm2(420萬畝)，居全國第 3 位，產(chǎn)量近 24×104t[3]。核桃樹腐爛病在新疆發(fā)生較為普遍和嚴(yán)重，在一些樹齡較大的核桃園一般年份發(fā)病率在 50% 左右，嚴(yán)重時可達(dá) 90% 以上，該病已成為影響核桃生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要原因[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Yu等[7]首次報道中國陜西省核桃樹腐爛病菌為Neofusicoccumparvum，唐俊煜等[5]依據(jù)無性型形態(tài)學(xué)特征，認(rèn)為新疆南疆核桃樹腐爛病菌為胡桃殼囊孢(Cytosporajuglandis(DC) Sacc)，而馬榮等[4]篩選新疆核桃腐爛病生防菌時所用病菌為金黃殼囊孢(C.chrysosperma)?！颈狙芯壳腥朦c】采用形態(tài)學(xué)特征和18 S rDNA-ITS、β-tubulin兩個基因序列分析，進(jìn)一步確定新疆南疆核桃腐爛病菌的種類，為核桃腐爛病的有效防治提供依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】進(jìn)一步確定南疆核桃樹腐爛病菌的種類，采集、分離核桃樹腐爛病菌，并采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其種類，為核桃腐爛病的有效防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材 料

從阿克蘇地區(qū)阿拉爾市塔里木大學(xué)核桃資源圃內(nèi)采集腐爛病樣 4 份；從巴音郭楞蒙古自治州庫爾勒市周邊采集病樣 1 份；從阿克蘇地區(qū)兵團(tuán)第一師 3 團(tuán)采集病樣 5 份。共計采集樣品 10 份，所采集樣品均有典型的黃褐色卷須狀分生孢子角(圖1A)。圖1

1.2方 法

1.2.1病原分離與純化

采用常規(guī)組織分離法[8]分離病原菌。在 PDA 平板上進(jìn)行分離，待分離物長出后，在WA 平板上進(jìn)行單孢純化，將純化后獲得的菌株保存在 PDA 斜面上，置 4℃ 冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 .2致病性測定

采用離體枝條接種法[9]進(jìn)行致病性測定。選取 2 年生健康的核桃樹枝條，截成20 cm 長的小段，自來水沖洗后用 0.1% HgCl2浸泡 1 min, 然后用無菌水沖洗、晾干，枝條頂端用保鮮膜將保濕脫脂棉包裹。用燒熱的鐵釘釘帽(直徑 7 mm)燙傷樹皮，以菌絲塊( 7 mm)作為接種體，在接種部位上方 1～2 cm 處加一塊濕的脫脂棉，用保鮮膜將其和接種體同時包扎。每個分離物接種5 個枝條。每個枝條上接種 2 塊，隨機(jī)選取 1 個傷口，以無菌 PDA 餅為空白對照。于 7 d 后觀察、記錄枝條發(fā)病情況，并對發(fā)病枝條進(jìn)行再分離。

1.2.3病原鑒定1.2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

供試菌株接種在離體核桃枝條上，待其產(chǎn)生產(chǎn)孢體后，挑取產(chǎn)孢體，用雙面刀片直接切片，制成玻片后在生物顯微鏡下觀察縱、橫切面形態(tài)特征并測量分生孢子大小，記錄并拍照[10,11]。

1.2.3.2分子鑒定

依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，挑選ALE-2、3-10、3-12和KEL-6這4株代表菌株在 PDA 平板上培養(yǎng) 5 d后，采用Lee等[12]的方法提取菌絲基因組DNA。借鑒Peever 等[13]的方法，用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增代表菌株的ITS和5.8 S rDNA，用引物Beta-2a和Beta-2b擴(kuò)增代表菌株的β-tubulin 基因。PCR反應(yīng)體系：PCRTaqMix 12.5 L、10 mol/L ITS1/ Beta-2a 1 L、10 mol/L ITS4/ Beta-2b 1 L、基因組 DNA 0.5 L、ddH2O 10 L至終體積為 25 L。ITS 基因 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序為94 ℃ 預(yù)變性 4 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸 10 min；β-tubulin基因 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 4 min，然后94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，共 30個循環(huán)，最后 72℃延伸 10 min。反應(yīng)完成后，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。

將不同引物的PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步純化后委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。測序后的序列經(jīng)校正后，在核酸序列數(shù)據(jù)庫 GenBank 中進(jìn)行同源序列搜索( BLAST搜索)，比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的同源程度。用 MEGA5 軟件進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)樹，應(yīng)用自展法(bootstrap) 檢驗系統(tǒng)樹，自展數(shù)據(jù)集為 1 000 次。

2結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性

人工接種 2 年生健康的核桃枝條后，10 個分離菌株均可導(dǎo)致核桃枝條發(fā)病。接種 7 d 后接種部位出現(xiàn)褐色、水浸狀病斑。隨后病斑縱向橫向擴(kuò)展至繞枝條一周。枝條病斑部位表皮皺縮，病健交界明顯(圖1B)。接種 15 d后，病斑表面產(chǎn)生大量黑色小點，室溫干燥條件下產(chǎn)孢體孔口會溢出黃色分生孢子角，對發(fā)病組織進(jìn)行再分離，均可獲得相應(yīng)的接種菌株。對照枝條上未出現(xiàn)癥狀。圖1

注：A,核桃腐爛病癥狀；B,離體接種后發(fā)病的核桃枝條

Note：A, Disease symptoms of canker ofJuglans; B, Valsa canker symptoms on stems after inoculation in vitro

圖1核桃樹腐爛病癥狀及致病性測定結(jié)果
Fig.1 Disease symptoms and pathogenicity test of valsa canker ofJuglans

2.2形態(tài)鑒定

病菌菌落較緊密，菌落白色至乳白色，菌落背面米黃色。培養(yǎng)后期褐色產(chǎn)孢體隨機(jī)在菌落分布(圖2A，2B)。子座埋生在樹皮中，突出，褐色，圓形至橢圓形，直徑 1.5～1.9 mm；孔口 1 個，黑色，與頂盤同高；分生孢子器由大量內(nèi)陷的小腔室組成，共用壁，內(nèi)陷不規(guī)則排列呈迷宮狀；分生孢子透明、香蕉形，(3.5～5.0)m×(0.9～1.4)m(圖3A,B,C)，依據(jù)形態(tài)特征將病原菌鑒定為C.chrysosperma。圖2，圖3

圖2C.chrysosperma在PDA培養(yǎng)基上菌落特征
Fig. 2Colonycharacteristicsof isolates on PDA

注：A：分生孢子器縱切；B：分生孢子器橫切；C：分生孢子

Note：A-B:longitudinal and tangitial section through pycnidia; C.conidiospore

圖3C.chrysosperma形態(tài)特征
Fig.3Morphologic characteristics ofC.chrysosperma

2.3分子鑒定

分離菌株的 DNA 提取后經(jīng)電泳檢測，所得 DNA 片段約為2 000 bp。利用ITS和β-tubulin兩個基因?qū)υ摬≡M(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測分別獲得一條大小約為 550 bp 和 500 bp 的清晰條帶，將所測得的序列登陸 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast)進(jìn)行 Blast 比對，4 個代表菌株的rDNA ITS序列( 登錄號分別KT428021.1，KT590421.1，KT428023.1，KT428029.1)與已登錄的菌株C.chrysosperma(KP114125) 相似性達(dá)到99% ，4 個代表菌株的β-tubulin基因(登錄號分別KT428033.1，KT590411.1，KT428034.1，KT428040.1)與已登錄的菌株C.chrysosperma(KP117038) 相似性達(dá)到98%。通過MEGA5 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，4 株代表菌株和C.chrysosperma(登錄號：EU622277，KJ739480，KF498689， KF498682)處于同一個分枝上，相似性較高。圖4～6

目前關(guān)于核桃樹腐爛病病原菌報道的種類較多。Haggag等[14]依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和 ITS 序列分析，鑒定埃及核桃腐爛病原物為Botryodiplodiatheobromae。而 Montecchio 等[15]研究認(rèn)為在歐洲核桃腐爛病是由真菌Geosmithiamorbida及昆蟲Pityophthorusjuglandis共同危害所致。劉振坤等[16]依據(jù)形態(tài)學(xué)特征將新疆核桃樹腐爛病菌鑒定為胡桃殼囊孢(C.juglandis)。唐俊煜等[5]對新疆南疆 9 種林木腐爛病菌形態(tài)學(xué)比較后，認(rèn)為病原菌也為胡桃殼囊孢 (C.juglandis)。研究依據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定，18 S rDNA-ITS 和 β-tubulin 基因序列分析，明確了引起新疆南疆核桃腐爛病的病原菌為金黃殼囊孢(C.chrysosperma)，這與馬榮等[4]研究結(jié)果一致。

注：A,ITS序列；B,β-tubulin基因

圖4 核桃腐爛病菌代表菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.4PCR products of rDNA-ITS,β-tubulin ofCytosporachrysosperma

圖5 代表菌株基于 ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.5 Phylogram using ITS sequences data

圖6 代表菌株基于β-tubulin 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6Phylogram using β-tubulin sequences data

3討 論

金黃殼囊孢(C.chrysosperma)除危害核桃外，還可危害楊樹、柳樹、桉樹等多種林木樹種，在西北、華北及東北地區(qū)是危害楊樹生產(chǎn)的主要病原因子[17]。楊明秀等[18]從各地楊樹、柳樹、核桃等多種寄主均可分離得到C.chrysosperma，且致病性與寄主有關(guān)，即在楊樹上分離的菌對楊樹的致病性強(qiáng)于非楊樹寄主，但與地理位置無明顯關(guān)系。

腐爛病已成為新疆林木的主要病害之一，在新疆喀什地區(qū)、和田地區(qū)核桃樹腐爛病發(fā)生嚴(yán)重，個別重病園發(fā)病率達(dá) 70%～90%，嚴(yán)重者整園死亡，已對南疆核桃生產(chǎn)和發(fā)展造成嚴(yán)重威脅[4]。研究明確了新疆南疆核桃樹腐爛病的病原菌種類，將為核桃樹腐爛病的防治提供一定的指導(dǎo)。

4結(jié) 論

從新疆南疆采集核桃腐爛病樣10份，分離得到10株分離物，經(jīng)致病性測定、形態(tài)學(xué)特征、18S rDNA-ITS、β-tubulin 兩個基因序列分析，明確南疆核桃樹腐爛病病原菌是金黃殼囊孢(C.chrysosperma)。

金黃殼囊孢(C.chrysosperma)與新疆已報道的新疆楊、箭桿楊、胡楊、柳樹等樹木上的腐爛病菌為一個種[20]。致病性測定結(jié)果也表明，該菌既可侵染核桃樹，也可侵染新疆楊、箭桿楊、胡楊、柳樹等樹木，表明金黃殼囊孢(C.chrysosperma)有廣泛的寄主范圍，可危害新疆多種林木寄主，但該病原菌在幾種林木上能否傳播以及不同寄主來源的病菌是否存在致病性差異還有待于進(jìn)一步研究。

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Identification of Canker Pathogen ofJuglansin Southern Xinjiang

GUO Kai-fa，WANG Gang，WU Cai-lan，BAO Ya-zhou，ZHAO Si-feng

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

Abstract：【Objective】 To isolate and identify canker pathogen of Juglans in Xinjiang.【Method】 A total of 10 canker samples in Juglans were collected and 10 isolates were obtained by tissue isolation, and pathogenicity was determinaed according to Koch's rule. These isolates were identified by means of the morphological features of culture, 18S rDNA-ITS and β-tubulin gene sequences analysis.【Result】Through colony morphology, pycnidium, conidia of the isolates was consistent with the reported Cytospora chrysosperma. ITS identification showed the sequence was up to 99% identical with C. chrysosperma (KP114125.1), β-tubulin identification showed the sequence was up to 98% identical with C. chrysosperma ( KP117038.1).【Conclusion】These isolates from Xinjiang were identified as C. chrysosperma.

Key words:Juglans；Valsa canker；identification ；Cytospora chrysosperma

中圖分類號：S436.64

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)03-0496-06

作者簡介:郭開發(fā)(1985-)，男，甘肅武威人，博士研究生，研究方向為植物菌物病害及其防治，(E-mail)andygkf@126.com通訊作者:趙思峰(1975-)，男，四川巴中人，教授，博士，研究方向為生物農(nóng)藥,(E-mail)Zhsf_agr@shzu.edu.cn

基金項目:新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金專項“新疆主要林木腐爛病菌種類鑒定及其關(guān)鍵防治技術(shù)研究”(2014CB002)

收稿日期：2015-12-19

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.015

Fund project:Supported by Youth Science and Technology Innovation Funds of Xinjiang Production and Construction Corps "Species Identification and Key Prevention Technology of Forest Canker in Xinjiang"(2014CB002).