HPLC測定砷對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)GSH含量的影響

焦雪鑫,高嵐岳,方　瑩,霍韜光,張穎花,吳　輝,姜　泓*

(1.中國醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院, 遼寧 沈陽110122;　2.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院, 遼寧 大連 116600)

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HPLC測定砷對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)GSH含量的影響

焦雪鑫1,高嵐岳1,方瑩2,霍韜光1,張穎花1,吳輝1,姜泓1*

(1.中國醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院, 遼寧 沈陽110122;2.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院, 遼寧 大連 116600)

摘要：建立高效液相色譜法(HPLC)檢測星形膠質(zhì)細胞(AC)內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量的測定方法，探討急性砷暴露對AC內(nèi)GSH水平的影響，為砷對神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制研究提供檢測手段. 結(jié)果表明，該方法準確、靈敏、可靠. AC內(nèi)GSH含量隨急性砷暴露劑量增加而逐漸升高.

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；星形膠質(zhì)細胞；谷胱甘肽；砷

砷是自然界中廣泛存在的類金屬物質(zhì). 近年來，隨著對地方性砷中毒研究的深入，砷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響及作用機制也逐漸受到關(guān)注[1]. 國內(nèi)外流行病學調(diào)查均發(fā)現(xiàn)長期砷暴露可影響兒童的智力發(fā)育[2-4]；動物實驗研究也表明，砷可通過血腦屏障進入并蓄積在腦內(nèi)，產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)毒性[5-8]，但其毒性作用機制目前尚未完全的闡明. 星形膠質(zhì)細胞(Astrocytes，AC)是腦內(nèi)含量最多的細胞，具有維持細胞內(nèi)外環(huán)境、參與突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的清除與代謝等功能，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是細胞內(nèi)重要的抗氧化和解毒物質(zhì)之一，是維持細胞正常功能的自由基清除劑，對神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護作用. 本研究以體外培養(yǎng)Wistar 胎大鼠的AC為研究對象，采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)測定AC內(nèi)GSH的含量，探討急性砷暴露對AC內(nèi)GSH水平的影響，為砷對神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷機制研究提供檢測手段.

1實驗部分

1.1儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括G1312C二元泵，G1314F紫外檢測器，色譜數(shù)據(jù)工作站；3K-18超速冷凍離心機(日本日立公司)；MB100-2A微孔板恒溫振蕩器(杭州奧盛儀器有限公司)；ER-182A全自動電子天平(十萬分之一)(日本A&D公司)；超凈工作臺(上海蘇凈安泰公司)；Thermo二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，CKX31倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，Easypure純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司).

GSH標準品(美國Aladdin工業(yè)公司)；亞砷酸鈉(美國Fluka公司)，DEME培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)；7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽(SBD-F)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)和三氯乙酸(TCA)均購自美國Sigma公司；乙二胺四乙酸(EDTA)(遼寧沈陽制劑一廠)；甲醇、乙腈均為色譜純試劑(山東禹王集團)；其他試劑均為分析純試劑；實驗用水均為去離子水；所用玻璃器皿經(jīng)濃硫酸溶液浸泡24 h，用去離子水洗凈，高壓滅菌，備用.

1.2色譜條件

色譜柱：Thermo ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(體積比3.5∶96.5，pH 4.5)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量：20 μL.

1.3實驗方法

1.3.1AC原代培養(yǎng)及細胞分組與處理

取出生1～3天的Wistar 胎大鼠(由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，參照文獻[9]的方法培養(yǎng)AC. 將純化的AC隨機分為6組，待細胞形成單層后，分別換成砷濃度為0、50、100、200、400、600 μmol·L-1的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后，進行各指標檢測.

1.3.2GSH標準品溶液制備

精密稱取GSH標準品，去離子水溶解定容，得到5 mmol/L GSH標準品儲備液，置于4 ℃冰箱中保存.

1.3.3AC樣品制備

長滿皿底的細胞經(jīng)“1.3.1”項下方法處理后，收集細胞，于3 500 g，離心5 min，棄上清，加入RIPA細胞裂解液，4 ℃裂解1 h，12 000 rpm，4 ℃離心15 min，取上清，按BCA試劑盒所述方法進行蛋白測定，其余上清貯存于-80 ℃冰箱待測.

1.4方法學考察

1.4.1標準曲線與檢測限

取6批AC混合裂解液100 μL，加入100 μL GSH標準品溶液，得相當于濃度為2、5、10、20、50 μmol·L-1的GSH混合細胞樣品，按樣品處理方法進行測定，以混合細胞樣品的GSH濃度為橫坐標，對應色譜峰面積為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸計算，求得直線的回歸方程，即為標準曲線. 檢測限為空白的3倍積分面積.

1.4.2精密度與準確度

取混合AC裂解液100 μL，加入100 μL GSH標準溶液，得濃度為5、20、50 μmol·L-1的GSH質(zhì)控樣品(QC)，每一濃度制備6個平行樣品，分別每天測定1次連續(xù)測定3天，計算日間精密度；同一細胞樣品1天內(nèi)連續(xù)測定6次，計算日內(nèi)精密度；當日的標準曲線計算QC樣品的測定濃度，與配制的濃度做對照，求得此方法的準確度.

1.4.3回收率

取QC，每一濃度制備3個平行樣本進行分析；另外制備空白樣品，即取混合裂解液100 μL，加入100 μL去離子水，以同樣的方法測定. 方法回收率=(測得的質(zhì)控樣品濃度-測得的空白樣品濃度)/加入的GSH標準溶液濃度.

1.5AC內(nèi)GSH含量的測定

將-80 ℃保存的細胞樣品復溫，精密量取標準品溶液和細胞樣品各100 μL，分別加入50 μL 12 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)和10μL 50 mmol/L TCEP，混勻，于25 ℃還原10 min后，加入1 mmol/L的EDTA 45 μL，混勻后加入1% TCA 45 μL沉淀蛋白，混勻，于10 000 rpm，4 ℃離心10 min. 精密吸取上清液100 μL，加入SBD-F 50 μL 衍生化，混懸5 s，于60 ℃反應1 h，于10 000 rpm，4 ℃離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，注入HPLC中.

1.6AC形態(tài)觀察

將純化的AC接種于6孔板中，按上述“1.3.1”項下方法染毒培養(yǎng)4 h，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學并攝像.

1.7統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，用SPSS 17.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進行各指標組間差異的顯著性檢驗，以P<0.05作為檢驗的顯著性差異.

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件考察

根據(jù)上述色譜條件對樣品進行分析，圖1給出了空白試劑、GSH標準溶液和細胞樣品經(jīng)SBD-F衍生化后的HPLC色譜圖，由圖可見，細胞樣品中內(nèi)源性物質(zhì)及試劑對其測定無干擾，且各組之間的分離度良好，AC內(nèi)GSH在15 min內(nèi)均完全分離.

圖1　空白(A)、GSH標準品(B)和AC樣品(C)的HPLC圖Fig.1　HPLC graph of Blank (A), GSH standard (B) and AC sample (C)

名稱本底值/(μmol·L-1)加標值/(μmol·L-1)實測值(x±s)準確度(RE/%)日內(nèi)精密度(RSD/%)日間精密度(RSD/%)回收率/%(x±s)58.27±0.41-2.84.63.195.4±7.6AC3.52022.92±0.79-2.53.55.297.1±4.05052.11±1.33-2.62.62.897.3±2.7

表2　砷暴露AC內(nèi)GSH含量

注：*與對照組相比較，P<0.05；#與50 μmol·L-1砷染毒組相比較，P<0.05；

&與100 μmol·L-1砷染毒組相比較，P<0.05；+與200 μmol·L-1砷染毒組相比較，P<0.05.

2.2方法學考察

2.2.1標準曲線與檢測限

GSH在2～50 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度高，回歸方程為Y=1.95X+0.469 3(r=0.998 3)，檢測限為0.5 μmol/L.

2.2.2精密度、準確度及回收率

由表1可見，GSH衍生物日內(nèi)、日間精密度RSD均在2.6%～5.2%之間，準確度RE在-15%～15%范圍內(nèi)，AC樣品加標回收率在95.4%～97.3%范圍內(nèi)，表明測定AC內(nèi)GSH的分析方法精密度、準確度良好及回收率較高.

2.3AC內(nèi)GSH含量的測定

由表2可見，AC經(jīng)砷暴露4 h后，隨著砷濃度的增加，AC內(nèi)GSH含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，50、100 μmol·L-1砷組較對照組沒有顯著性差異(P>0.05)， 200、400、600 μmol·L-1砷組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，其中，200、400、600 μmol·L-1砷組與50 μmol·L-1、100 μmol·L-1砷組比較有顯著性差異(P<0.05)；400、600 μmol·L-1砷組與200μmol·L-1砷組比較也有顯著性差異(P<0.05).

2.4AC形態(tài)觀察

圖2顯示， 經(jīng)砷暴露4 h的AC，50、100 μmol·L-1砷組細胞形態(tài)與對照組比較未見明顯改變；但200 μmol·L-1砷處理后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，可見細胞輪廓增強，細胞的折光性變強，細胞產(chǎn)生圓縮和脫落，細胞空隙增大，且隨著砷暴露劑量的增加，400、600 μmol·L-1砷組細胞數(shù)量明顯減少，死細胞大量增加.

2.5討論

含巰基化合物的測定方法較多，如熒光光度法、比色法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[11]等，其中熒光光度法和比色法靈敏度低、特異性差，而HPLC-MS和GC-MS儀器較為昂貴，不能普遍應用. 目前，HPLC較為常用，但采用HPLC測定體外培養(yǎng)細胞內(nèi)GSH含量的報道較少. 采用HPLC測定GSH需要尋找合適的衍生化試劑，本文對3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(CNBF)和SBD-F兩種衍生化試劑進行分別考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者均可作為GSH測定的衍生化試劑，但氨基類衍生化試劑CNBF較SBD-F靈敏度低，對于GSH含量較高的生物樣品有較好的分離度，但對于AC內(nèi)低含量的GSH測定結(jié)果不佳，其分離度和靈敏度較差，因此，本文選用分離度和靈敏度較好的SBD-F作為衍生化試劑，該物質(zhì)能與硫醇物特異性反應，且其反應穩(wěn)定，色譜峰良好[12]. 同時，對樣品與衍生化試劑的比例進行考察，結(jié)果顯示，樣品與衍生化試劑為2∶1時，與其1∶1時相比較，測定的靈敏度更高且色譜峰較好、回收率較高，與其3∶1時的含量基本一致. 因此，本研究將樣品與衍生化試劑的比例定為2∶1. 此外，又對方法中的沉淀蛋白條件進行了優(yōu)化，結(jié)果選用1% TCA作為沉淀蛋白試劑較好.

圖2　不同劑量砷暴露AC形態(tài)學觀察(倒置顯微鏡，×200)Fig.2　Morphology of AC with different doses of arsenic exposure(inverted microscope, × 200)

砷是親硫物質(zhì)，易與巰基結(jié)合，而引起含巰基的酶、輔酶和蛋白質(zhì)生物活性功能的改變[13]. GSH是細胞內(nèi)豐富的非蛋白巰基，是維持細胞正常功能的自由基清除劑，對神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護作用，在毒物解毒過程和抵御過量氧化應激等方面發(fā)揮著重要的作用[14]. 本研究結(jié)果顯示，AC經(jīng)砷暴露4 h后，當給予200、400、600 μmol·L-1砷暴露后AC內(nèi)GSH的含量明顯升高，但有趣的是，當砷濃度大于200 μmol·L-1后，AC形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細胞輪廓、折光性變強，細胞產(chǎn)生圓縮和脫落，且細胞空隙增大，隨著砷暴露劑量的增加細胞數(shù)量明顯減少，死細胞大量增加，說明砷對AC產(chǎn)生了明顯的毒性損傷，且其損傷作用隨著砷暴露劑量的增加而增加. 截然相反的兩個結(jié)果，我們推測在急性砷暴露期GSH水平的升高，可能與GSH對AC產(chǎn)生的應激性保護作用和/或與GSH合成的相關(guān)酶的參與有關(guān). 調(diào)控GSH合成的相關(guān)酶是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)，其在對砷的解毒代謝和抗氧化中具有十分重要的作用[15-16]. 研究顯示，隨急性砷暴露劑量的增加，γ-GCS、GR和GST三種合成酶的含量上升，進而誘導GSH的合成增加[17].

3結(jié)論

建立的HPLC法適用于檢測AC內(nèi)GSH含量，該方法準確、靈敏、可靠，經(jīng)急性砷暴露的AC內(nèi)GSH含量隨暴露劑量的增加而升高，細胞形態(tài)隨其劑量增加發(fā)生明顯改變且死細胞數(shù)大量增加.

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[責任編輯：任鐵鋼]

Effect of the contents of GSH in astrocytes exposure to arsenic determined by HPLC

JIAO Xuexin1, GAO Lanyue1, FANG Ying2, HUO Taoguang1, ZHANG Yinghua1,

WU Hui1, JIANG Hong1*

(1.SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,Liaoning,China)

Abstract:A high performance liquid chromatography (HPLC) method was established to detect the contents of glutathione(GSH) and study the effect of acute arsenic exposure on the levels of GSH in astrocytes(AC). The research provides the detection method for investigation the mechanism of arsenic induced injury on the nervous system. The results showed that the method was accurate, sensitive and reliable. After acute arsenic exposure, the content of GSH in astrocytes gradually increased with an increasing dose of arsenic.

Keywords:high performance liquid chromatography; astrocyte; glutathione; arsenic

文章編號：1008-1011(2016)02-0206-05

中圖分類號：O657.7

文獻標志碼：A

作者簡介：焦雪鑫 (1989-),女,碩士生,研究方向為含重金屬礦物藥毒作用機制研究. *通訊聯(lián)系人, E-mail: jianghong@mail.cmu.edu.cn.

基金項目：國家自然科學基金(81473417；81403066).

收稿日期：2015-12-25.