人附睪蛋白4單克隆抗體與免放試劑盒的制備及其對卵巢癌診斷的臨床價值探討

王立凱 黃麗娟 潘學(xué)繼 張續(xù) 董全文

300301，天津市協(xié)和化學(xué)發(fā)光診斷試劑有限公司研發(fā)中心（王立凱）；300301，天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團有限公司，天津市免疫分析技術(shù)企業(yè)重點實驗室（王立凱、黃麗娟、潘學(xué)繼、張續(xù)、董全文）

人附睪蛋白4單克隆抗體與免放試劑盒的制備及其對卵巢癌診斷的臨床價值探討

王立凱 黃麗娟 潘學(xué)繼 張續(xù) 董全文

300301，天津市協(xié)和化學(xué)發(fā)光診斷試劑有限公司研發(fā)中心（王立凱）；300301，天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團有限公司，天津市免疫分析技術(shù)企業(yè)重點實驗室（王立凱、黃麗娟、潘學(xué)繼、張續(xù)、董全文）

目的 制備人附睪蛋白4（HE4）單克隆抗體并研制免放分析試劑盒，探討其在卵巢癌臨床診斷中的價值。方法 用重組人HE4免疫小鼠，通過細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)制備并篩選可以配對的HE4單抗，用125I標(biāo)記其中一株單抗，研制HE4免放試劑盒，并評價其檢測的靈敏度。通過檢測臨床血清標(biāo)本來評價其對卵巢癌診斷的靈敏度和特異度。結(jié)果 篩選出了一對親和力與特異性高的HE4單抗，其免放試劑盒檢測的靈敏度為3.65 pmol/L，其對卵巢癌的臨床診斷的靈敏度可達(dá)90.83%，特異度為99.17%。結(jié)論 制備的單克隆抗體親和力高，研制的免放試劑盒各項指標(biāo)較好，可用于卵巢癌的早期臨床診斷和療效觀察，降低卵巢癌患者的病死率。

人附睪蛋白4；卵巢腫瘤；抗體，單克?。幻庖叻派浞治?/p>

Fund program:Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program（13ZCZDSY01000）

人附睪蛋白 4（human epididymis protein-4，HE4）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤標(biāo)志物，主要是由附睪遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞中的HE4基因所表達(dá)，由124個氨基酸組成，在精子的成熟過程中起著關(guān)鍵作用。HE4作為一種新型的卵巢癌診斷指標(biāo)，其水平變化能反映卵巢癌發(fā)展的趨勢，并能監(jiān)測治療的效果。HE4在正常人體中的表達(dá)非常低，但在卵巢癌組織和患者血清中均高度表達(dá)；在惡性腫瘤中的高表達(dá)多見于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌。本研究旨在建立HE4雙抗體夾心免放分析方法，評價該測定方法的靈敏度、特異度、精密度，并通過血清標(biāo)本的檢測來探討HE4在卵巢癌臨床診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

HE4重組抗原購自美國Fitzgerald公司；Na125I是委托中國同位素公司代購美國PerkinElmer公司的產(chǎn)品；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和蛋白A親和層析柱由天健生物制藥有限公司提供（天津）；BALB/C小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購買自美國Gibco公司；弗氏佐劑購自美國Sigma公司；羊抗鼠IgG及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自美國Scanbody公司；Multiscan MK3型酶標(biāo)儀為芬蘭雷勃公司產(chǎn)品；紫外分光光度計為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；GC-911型γ計數(shù)放免分析儀為科大創(chuàng)新股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物免疫

10只6周齡的BALB/C小鼠，將弗氏完全佐劑與HE4重組抗原乳化后進行腹腔注射，免疫劑量為50 μg/只。首次免疫后將弗氏不完全佐劑與HE4重組抗原乳化后進行腹腔注射，每2周進行1次加強免疫注射，免疫劑量為25 μg/只。加強免疫3次后，通過小鼠靜脈采血，用ELISA法測定血清中抗體效價。當(dāng)抗體效價達(dá)到1∶50 000，于細(xì)胞融合前3 d時再進行1次加強免疫（小鼠進行腹腔注射，免疫劑量為50 μg/只）。

1.2.2 細(xì)胞融合與篩選及亞克隆

本實驗室采用最新的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞融合技術(shù)，選取抗體效價最好的小鼠，收集脾淋巴細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進行融合（用低分子量的聚乙二醇誘導(dǎo)）。將融合后的雜交瘤細(xì)胞接種至96微孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，對培養(yǎng)基中的雜交瘤細(xì)胞進行ELISA篩選。將篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆于24孔培養(yǎng)皿上進行擴大培養(yǎng)。將確定為陽性的細(xì)胞克隆進行亞克隆以獲得能產(chǎn)生抗體并進行穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系。

1.2.3 單抗亞型測定

用羊抗鼠IgG二抗包被96孔酶標(biāo)板，在各孔中加入50 μl雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清，并設(shè)立空白對照。37℃溫育0.5 h后，再往各孔中分別加入50 μl HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，37℃溫育30 min。洗板3次，加入100 μl 3,3′,5,5′,-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色，加入終止液后用酶標(biāo)儀測定其450 nm處的OD值。

1.2.4 單克隆抗體的批量制備及純化

針對每株雜交瘤細(xì)胞進行一次小批量的腹水生產(chǎn)（6只小鼠/株），用蛋白A層析柱從腹水樣本中分離純化單克隆抗體。通過紫外分光光度計測定抗體的濃度，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定抗體的純度。

1.2.5 HE4標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將0.05 mol/L、pH=7.2的PBS與胎牛血清配制成基礎(chǔ)緩沖液，加入重組人HE4抗原，配制出濃度分別為0、30、80、200、500、1300 pmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 包被管的制備

配制pH=9.0的0.01 mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液；向其中加入HE4單克隆抗體，濃度為4 mg/L；將配制好的包被液按200 μl/管加入聚苯乙烯塑料管內(nèi)；2～8℃放置24 h，倒掉液體，加入1.0 ml PBS洗管2次；200 μl/管封閉液（0.01 mol/L PBS，10 g/L BSA）2～8℃放置2 h后，將封閉液倒掉，晾干待用。

1.2.7 標(biāo)記物的制備方法

取1 μg/μl鼠抗人HE4單克隆抗體100 μl，加入3.7×107Bq的Na125I，用磁力攪拌子邊攪拌邊加入氯胺T 30 μl（4.0 mg/ml）反應(yīng)30 s；立即加入Na2S2O350 μl（4.0 mg/ml）反應(yīng)20 s。用凝膠層析柱純化分離，用PBS-BSA緩沖液配制標(biāo)記物工作液，使100 μl標(biāo)記物的每分鐘放射性計數(shù)約為20萬，2～8℃保存待用。

1.2.8 HE4免疫放射分析方法的建立

試劑盒上述主要組分制備完成以后，經(jīng)過一系列的對比篩選試驗，最終確定了HE4試劑盒的最佳操作方法和溫育條件。

1.2.9 分析靈敏度的測定

連續(xù)測定20管零標(biāo)準(zhǔn)品，將其每分鐘放射性計數(shù)值做統(tǒng)計，求出其平均值（X）及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），取X＋2SD在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的濃度值即為本方法的分析靈敏度[1]。

1.2.10 精密度的測定

批內(nèi)變異性：取低、高兩個不同濃度的混合血清樣品進行檢測。每個樣品做20管，計算測定濃度的X、SD，然后計算X/SD×100%，即為本方法的批內(nèi)變異性；批間變異性：測定低、高濃度樣品各10管，重復(fù)3次，計算3次測定的變異性。

1.2.11 回收率的測定

取一定量的HE4抗原，將其溶解于人基礎(chǔ)血清中，配制成高、中、低3個不同濃度的樣品，用本方法測定其濃度，然后計算實際測定值與理論值之間的比例即為回收率。

1.2.12 正常值范圍的確定

采集200名正常人血清，用自制的HE4免放試劑盒測定其濃度，計算其X、SD，計算X＋2SD即為正常參考值上限，小于該值即為正常[1]。

1.2.13 臨床標(biāo)本的檢測

測定120例用羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑定值的卵巢癌患者血清樣本，計算其陽性率；測定120名用羅氏試劑定值的正常人血清樣本，計算其陰性率。并對測定結(jié)果進行對比分析。

3.3 科學(xué)合理用藥，綜合防治韭蛆 一是加強肥水管理，提高植株自身抗性，創(chuàng)造有利于韭菜生長，而不利于韭蛆等病蟲害生長的生態(tài)環(huán)境條件。二是合理輪作，根據(jù)韭蛆危害程度確定適宜的輪作時間，至少與非百合科作物如辣椒、番茄、黃瓜等輪作3年以上。三是加強田間管理，及時清除韭菜殘葉和雜草，沿寬行和簇間深鋤松土，剔除簇心土，曬根晾土。四是使用腐熟的有機肥，提倡使用豆粕、菌渣等有機肥。五是提倡使用生物農(nóng)藥或采用高效、低毒、低殘留化學(xué)農(nóng)藥，保障韭菜生產(chǎn)質(zhì)量安全。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞融合及陽性克隆篩選

通過對免疫小鼠血清抗體效價的測定，選取了1號、3號小鼠進行細(xì)胞融合，經(jīng)陽性克隆篩選及亞克隆后，共獲得了2株可以穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株，分別命名為1A5和3D2，并對這兩株細(xì)胞所分泌的抗體進行了亞型測定，結(jié)果顯示均為IgG1型單抗。

2.2 單抗的批量制備及純化

將上述 1A5和 3D2細(xì)胞株分別接種 6只BALB/C小鼠后，分別得腹水18.4 ml和20.7 ml，用蛋白A層析柱分離純化后各得單克隆抗體66.3 mg和68.1 mg。用紫外分光光度計測定抗體的濃度分別為5.2 mg/ml和5.63 mg/ml。

2.3 單抗的純度鑒定

將1A5和3D2兩株單抗分別進行SDS-PAGE凝膠電泳（圖1），兩株單抗的電泳結(jié)果均為兩條帶，相對分子質(zhì)量分別為25 000的輕鏈和50 000的重鏈。經(jīng)掃描圖譜分析后計算得出兩株單抗的純度均＞95%。

圖1 純化人附睪蛋白4單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE photo for purified human epididymis protein 4 monoclonal antibodies

2.4 抗體配對結(jié)果

經(jīng)過一系列的篩選試驗，最終確定本試劑盒的操作方法為：取100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及血清標(biāo)本加入包被試管，然后再加入100 μl125I標(biāo)記的單抗工作液，室溫振蕩1 h，吸去管中液體，加入1 ml洗液洗管2次，然后再用γ計數(shù)器測定每管1 min內(nèi)的放射性強度計數(shù)，測定結(jié)果如圖2所示，可以看出，2株HE4單克隆抗體配對結(jié)果較好，非特異性結(jié)合率低，標(biāo)準(zhǔn)品各點的結(jié)合率梯度拉差明顯，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好。

圖2 人附睪蛋白4免疫放射分析法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of human epididymis protein 4 immunoradiometric assay

通過測定20管零標(biāo)準(zhǔn)品，得出本試劑盒的分析靈敏度為3.65 pmol/L。

2.6 精密度測定結(jié)果

通過對濃度分別為60、300 pmol/L的兩個血清樣本進行測定，計算出其批內(nèi)變異性分別為5.31%和3.59%，其批間變異性分別為7.52%和5.17%。

2.7 回收率測定結(jié)果

通過對濃度分別為60、300和1200 pmol/L的3個血清樣本測定，計算回收率分別為103.69%、102.64%和98.42%。

2.8 正常值范圍的測定結(jié)果

測定了200名正常人血清，計算濃度的X= 98.43 pmol/L、SD=23.16、X＋2SD=144.75 pmol/L。因此，確定本試劑盒測定的正常值范圍為＜145pmol/L。

2.9 臨床樣本的檢測

通過對120例卵巢癌患者和120名正常人的血清樣本的測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，本試劑盒的臨床靈敏度可達(dá)90.83%、特異度為99.17%，基本接近羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒的測定結(jié)果（表1）。

表1 人附睪蛋白4臨床血清樣本測定結(jié)果Table 1 Clinical test result of human serum for human epididymis protein 4

3 討論

卵巢癌是目前最常見也是病死率最高的婦科腫瘤之一，中國每年約每2萬女性中就有1人被診斷為卵巢癌。因臨床癥狀不明顯，很易造成漏診與誤診，近75%的卵巢癌患者確診時已處于晚期并擴散到其他器官，錯過了最佳治療時機。如卵巢癌發(fā)展到后期擴散到其他腹部器官才確診，患者的5年生存率僅為17%。如能在轉(zhuǎn)移前得到診斷，患者的生存率可以達(dá)90%以上。目前卵巢癌的主要血清標(biāo)志物是CA125，但其靈敏度、特異度并不理想。因此，探討對卵巢癌更靈敏、特異度高的早期診斷指標(biāo)是非常必要的。HE4在早期及中后期的卵巢癌診斷中的靈敏度均高于CA125，特異度也優(yōu)于CA125[2-3]。HE4與CA125聯(lián)合應(yīng)用，靈敏度可高達(dá)92%，可以減少30%～50%生物標(biāo)志物陰性卵巢癌的漏診，大大提高了卵巢癌診斷的準(zhǔn)確率[4-6]。

本研究制備了一對高親和力、高特異度的HE4單抗，用其研制出了HE4免放試劑盒，并對其在卵巢癌檢測中的臨床靈敏度及特異度進行了測定分析。對120例卵巢癌患者血清和120名正常人血清樣本的檢測結(jié)果進行分析，其臨床測定的靈敏度可達(dá)90.83%，特異度為99.17%，基本接近進口羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒的測定結(jié)果，優(yōu)于目前國內(nèi)已報道結(jié)果[7]。由于目前國內(nèi)市場上的HE4被進口類產(chǎn)品所壟斷，檢測時需要有配套的大型儀器，且價格昂貴。本試劑盒與進口試劑相比，價格便宜，且操作方便快捷，對各型放免分析儀器完全開放，更適于在中小型醫(yī)院及體檢公司使用，可廣泛應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷，有效提高卵巢癌的早期檢出率，可做到早診斷早治療，降低卵巢癌的病死率。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 王立凱負(fù)責(zé)研究命題的提出與設(shè)計、方法建立和論文撰寫；黃立娟負(fù)責(zé)單克隆抗體的制備；潘學(xué)繼負(fù)責(zé)標(biāo)記物制備及技術(shù)指導(dǎo)、論文審閱；張續(xù)負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理與分析；董全文負(fù)責(zé)論文修訂。

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理局.腫瘤標(biāo)志物類定量檢測試劑注冊申報資料指導(dǎo)原則[EB].2011-03-24,http：//www.sda.gov.cn/ WS01/CL0274/60448.html. China Food and Drug Administration.Guiding principles for registration of quantitative detecting kits of tumor markers[EB].2011-03-24,http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0274/60448.html.

［2］董麗,昌曉紅,葉雪,等.血清人附睪分泌蛋白4和CA125水平檢測在卵巢癌中的診斷價值[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2008,43（12）：931-936.DOI：10.3321/j.issn：0529-567X.2008.12.013. Dong L,Chang XH,Ye X,et al.The values of serum human epididymis secretory protein 4 and CA125 assay in the diagnosis of ovarian malignancy[J].Chin J Obstet Gynecol,2008,43（12）：931-936.

［3］Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymisspecific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod,1991,45（2）：350-357.

［4］劉曉宇,姜潔.血清腫瘤標(biāo)志物人附睪蛋白4在卵巢癌診斷中的研究進展[J].腫瘤,2010,30（8）：711-714.DOI：10.3781/j.issn.1000-7431.2010.08.015. Liu XY,Jiang J.Serum human epididymis protein 4 as a tumor marker in the diagnosis of ovarian cancer[J].Tumor,2010,30（8）：711-714.

［5］張衛(wèi)云,孫朝暉,李薇,等.人附睪蛋白4與血清CA125聯(lián)合檢測在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價值[J].生物技術(shù)通訊,2013,24（4）：549-551.DOI：10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.025. Zhang WY,Sun ZH,Li W,et al.Diagnostic Value of Combined Detection of Human Epididymis Protein 4 with Serum CA125 in Ovarian Epithelial Cancer[J].Lett Biotech,2013,24（4）：549-551.DOI：10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.025.

［6］Moore RG,McMeekin DS,Brown AK,et al.A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass[J].Gynecol Oncol, 2009,112（1）：40-46.DOI：10.1016/j.ygyno.2008.08.031.

［7］王慜杰,齊軍,王海,等.人附睪蛋白4與糖類抗原125聯(lián)合檢測在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價值[J].中華腫瘤雜志,2011,33（7）：540-543.DOI：10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2011.07. 015. Wang MJ,Qi J,Wang H,et al.Diagnostic value of combining detection of human epididymis protein 4 and CA125 in patients with malignant ovarian carcinoma[J].Chin J Oncol,2011,33（7）：540-543.

Preparation of monoclonal antibodies and immunoradiometric assay kit against human epididymis protein 4 and its clinical value in diagnosis of ovarian cancer

Wang Likai,Huang Lijuan,Pan Xueji, Zhang Xu,Dong Quanwen
Union CLIA Diagnostic Technology（Tianjin）Ltd.,Tianjin 300301,China（Wang LK）;Key Lab of Immunoassay Technology for Tianjin′s Companies,Union Medical&Pharmaceutical Technology Group（Tianjin）Ltd.,Tianjin 300301,China（Wang LK,Huang LJ,Pan XJ,Zhang X,Dong QW）

Wang Likai,Email:research@union-med.com

Objective To prepare monoclonal antibodies and immunoradiometric assay kit against human epididymis protein 4(HE4)and study its clinical value in diagnosis of ovarian cancer.MethodsBALB/c mice were immunized with recombinant HE4 antigen,2 paired monoclonal antibodies were generated through splenic cell and myeloma cell fusion and screening.The detection antibody was labeled with 125 Iodine and immunoradiometric assay kit for HE4 was developed.The detect sensitivity of the kit was determined,and its clinical sensitivity and specificity in diagnosis of ovarian cancer was evaluated.ResultsTwo paired monoclonal antibodies with high affinity and specialty were generated. The detect sensitivity of this immunoradiometric assay was 3.65 pmol/L,and the clinical sensitivity and specificity in diagnosis of ovarian cancer was 90.83%and 99.17%respectively.ConclusionsThis study was prepared by a high affinity monoclonal antibodies against HE4,and the technical indexes of HE4 immunoradiometric assay kit were rather good.So it could be used in early diagnosis and curative effect observation of ovarian cancer,and reduce its lethality rate.

Human epididymis protein-4;Ovarian neoplasm,antibodies Monoclonal;Immunoradiometric assay

王立凱，Email：research@union-med.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.03.005

2013年天津市科技支撐計劃重點項目（13ZCZDSY01000）

2016-02-26）