綠色木霉自絮凝固定化條件研究

邢歡，許文宗，李婕，徐仰倉(cāng)，2，*（.天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457；2.天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

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綠色木霉自絮凝固定化條件研究

邢歡1，許文宗1，李婕1，徐仰倉(cāng)1，2，*
（1.天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457；2.天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

摘要：探究綠色木霉自絮凝固定化條件，以便提高其分泌纖維素酶的能力。首先測(cè)定固定化時(shí)間、體積、pH、葡萄糖與蛋白胨濃度對(duì)自絮凝固定化綠色木霉分泌纖維素酶的影響，然后用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化組合。時(shí)間、體積和pH對(duì)自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶的影響均呈鐘形曲線(xiàn)；葡萄糖對(duì)自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶影響不大；蛋白胨對(duì)自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶影響較大。綠色木霉自絮凝固定化最優(yōu)條件是：時(shí)間為6 d，pH為6，體積為70 mL，葡萄糖為2.25%，蛋白胨為1.50%。按此條件培養(yǎng)自絮凝固定化的綠色木霉72h，分泌的纖維素酶活性為3.55 U。

關(guān)鍵詞：自絮凝；正交試驗(yàn)；綠色木霉；纖維素酶

*通信作者

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，占陸地生態(tài)系統(tǒng)生物量的80 %，每年通過(guò)全球生物合成可再生性纖維素達(dá)1 000億t以上[1]。綠色木霉是產(chǎn)纖維素酶的高產(chǎn)菌株之一[2]，綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)纖維素有降解作用，纖維素可以被降解為人類(lèi)可直接利用的葡萄糖，以解決世界糧食問(wèn)題；也可降解為乙醇，以解決世界能源問(wèn)題；還可破壞植物細(xì)胞壁，以提高天然活性產(chǎn)物的提取率等。由于固定化細(xì)胞具有生長(zhǎng)快、反應(yīng)快、抗污染能力強(qiáng)、可連續(xù)使用、提高產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率，便于產(chǎn)物分離等特點(diǎn)，正越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于食品與發(fā)酵工業(yè)中[3]，綠色木霉固定化技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)成為現(xiàn)在食品工業(yè)微生物研究的主要趨勢(shì)之一[4]。優(yōu)化與改進(jìn)綠色木霉的固定化條件對(duì)于提高產(chǎn)纖維素酶活和延長(zhǎng)產(chǎn)酶半衰期尤為重要[5]，而應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化綠色木霉自絮凝固定化條件的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，我們采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以纖維素酶活為指標(biāo)，對(duì)影響綠色木霉固定化的一些關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究與分析。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

綠色木霉（Trichoderma viride AS3.3711）購(gòu)自中科院微生物研究所。

1.1.2儀器

752N 752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀有限公司；2PG-280智能光照培養(yǎng)箱：黑龍江東拓儀器制造公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1綠色木霉自絮凝固定化

采用PDA固體培養(yǎng)基[6]培養(yǎng)綠色木霉，待表面長(zhǎng)出綠色孢子后將其接入到PDA液體培養(yǎng)基中。PDA液體培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，馬鈴薯濃度為20 %，溫度為28℃，pH為自然，體積為70 mL，靜態(tài)光照固定培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

1.2.2纖維素酶活力測(cè)定

參照趙凱[7]的方法，略加改動(dòng)，反應(yīng)體系包括：0.5 mL酶液、1.5 mL檸檬酸緩沖液、3 mL DNS試劑，540 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)還原糖的生成量計(jì)算酶活性，酶活力單位定義：發(fā)酵液在（50±0.1）℃，pH 4.8條件下，1 h水解濾紙底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.2.3單因素對(duì)綠色木霉自絮凝效果的影響

1.2.3.1固定時(shí)間對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，pH為自然，培養(yǎng)體積為70 mL，固定化時(shí)間：5、6、7、8、9、10 d。研究時(shí)間對(duì)綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.2固定pH對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，培養(yǎng)體積為70 mL，固定化時(shí)間為6 d，pH：5、5.5、6、6.5、7、7.5。研究pH對(duì)綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.3固定體積對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，固定化時(shí)間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積：30、40、50、60、70、80 mL。研究體積對(duì)綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.4葡萄糖對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

蛋白胨濃度為2.00 %，固定化時(shí)間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積為70 mL，葡萄糖濃度：1.25 %、1.50 %、1.75 %、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究葡萄糖對(duì)綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.5蛋白胨對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.25 %，固定化時(shí)間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積為70mL，蛋白胨濃度：1.25%、1.50%、1.75%、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究蛋白胨對(duì)綠色木霉固定化的影響。

1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[8-9]，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取葡萄糖，蛋白胨，pH，體積，時(shí)間為試驗(yàn)因素。對(duì)各因素安排5個(gè)等間距濃度梯度，設(shè)誤差列，按L25（56）正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)。測(cè)定纖維素酶活力，確定最優(yōu)固定化條件。采用Excel和Latin軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2　結(jié)果與分析

2.1綠色木霉自絮凝固定化

綠色木霉在PDA液體表面按照三角錐形瓶的形狀自絮凝形成圓形膠塊。經(jīng)測(cè)定自絮凝塊的平均直徑為5.4 cm，質(zhì)量為0.42 g，培養(yǎng)液中纖維素酶的活性為2.55 U，綠色木霉自絮凝形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1　自絮凝固定化的綠色木霉Fig.1 Self-flocculating T.viride

2.2單因素對(duì)綠色木霉自絮凝效果的影響

2.2.1固定時(shí)間對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

將50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基倒入自絮凝的綠色木霉中，在28℃，110r/min下培養(yǎng)72 h。之后，利用濾紙酶活法測(cè)纖維素酶活性。固定時(shí)間對(duì)綠色木霉自絮凝的影響見(jiàn)圖2。

圖2　固定時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.2 The effect of immobilization times on cellulase activity

由圖2可知，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，纖維素酶活增高。在6 d時(shí)達(dá)到最大，但時(shí)間進(jìn)一步增加時(shí)，纖維素酶活下降，可能是綠色木霉膠塊表面菌絲退化所致。

2.2.2固定pH對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

固定pH對(duì)綠色木霉自絮凝的影響見(jiàn)圖3。

圖3　固定pH對(duì)酶活力的影響Fig.3 The effect of pH on cellulase activity

由圖3可知，隨著pH增大，纖維素酶活增高，在6時(shí)達(dá)到最大。這是由于綠色木霉喜歡在偏酸性環(huán)境下生長(zhǎng)。但pH繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH偏高不利于綠色木霉進(jìn)行自絮凝，所成膠塊松散不完整。

2.2.3固定體積對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

固定體積對(duì)綠色木霉自絮凝的影響見(jiàn)圖4。

圖4　固定體積對(duì)酶活力的影響Fig.4 The effect of immobilization volume on cellulase activity

由圖4可知，隨著體積增大，纖維素酶活先下降，到達(dá)50mL時(shí)最低，之后酶活性與體積成正比，在70mL時(shí)，酶活達(dá)到最高。但體積繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降。體積主要是影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給量，較少的營(yíng)養(yǎng)供給使綠色木霉自絮凝形成的膠塊較薄甚至使綠色木霉不能自絮凝成膠塊，所以酶活較低。在較高體積時(shí)，膠塊偏小導(dǎo)致酶活降低。

2.2.4葡萄糖對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖對(duì)綠色木霉自絮凝的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著葡萄糖的增加，纖維素酶活增高，在2.25 %時(shí)為最大。葡萄糖提供碳源，實(shí)驗(yàn)中供給的碳源越多，綠色木霉自絮凝成膠情況就越好，自絮凝膠塊在發(fā)酵時(shí)所分泌的纖維素酶酶活就越高。

2.2.5蛋白胨對(duì)綠色木霉自絮凝的影響

蛋白胨對(duì)綠色木霉自絮凝的影響見(jiàn)圖6。

圖5　葡萄糖對(duì)酶活力的影響Fig.5 The effect of glucose on cellulase activity

圖6　蛋白胨對(duì)酶活力的影響Fig.6 The effect of peptone on cellulase activity

由圖6可知，隨著蛋白胨增加，纖維素酶活增高，在1.50 %時(shí)達(dá)到最大。但pH繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)蛋白胨濃度較低時(shí)，綠色木霉自絮凝成膠較好。蛋白胨濃度越高時(shí)，綠色木霉越難自絮凝且膠塊成松散狀態(tài)。

2.3綠色木霉自絮凝固定化產(chǎn)酶特性正交試驗(yàn)結(jié)果

為了確定5種因素的影響纖維素酶活順序以及最優(yōu)試驗(yàn)組合，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按L25（56）正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，綠色木霉自絮凝固定化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

續(xù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，5種因素中，對(duì)自絮凝綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活性影響從大到小重要性排序依次為：蛋白胨濃度＞培養(yǎng)體積＞時(shí)間＞pH＞葡萄糖濃度。蛋白胨濃度對(duì)綠色木霉自絮凝形成膠塊的影響較大，葡萄糖濃度的影響最低。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳的固定化條件為：時(shí)間為6 d，pH為6.5，培養(yǎng)體積為70 mL，葡萄糖濃度為2.25 %，蛋白胨濃度為1.50 %。對(duì)比單因素試驗(yàn)，除了pH得到的最優(yōu)條件不同，其它條件都相同。按照以上最優(yōu)試驗(yàn)A1B3C4D4E1結(jié)果設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行3次自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活力測(cè)定，所得樣品的酶活力均值為3.55 U，綠色木霉自絮凝固定化正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

由表3可知，當(dāng)顯著水平a=10%時(shí)，F(xiàn)D＞4.110，所以蛋白胨對(duì)自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)酶具有顯著性影響，而其它因素的F值均小于4.110，所以沒(méi)有顯著性影響。

3　討論與結(jié)論

經(jīng)過(guò)單因素與正交試驗(yàn)方法得到自絮凝固定化綠色木霉的最優(yōu)條件為：時(shí)間為6 d，pH為6.5，體積為70 mL，葡萄糖為2.25 %，蛋白胨為1.50 %。這些條件主要通過(guò)影響自絮凝膠塊的大小及薄厚來(lái)影響纖維素酶活性。相比于沒(méi)有優(yōu)化之前，纖維素酶活性提高到原來(lái)的1.4倍。試驗(yàn)表明固定時(shí)間越長(zhǎng)，PDA溶液中的綠色木霉由于缺少氧氣停止生長(zhǎng)，菌絲附著停止甚至退化死亡。pH偏高或偏低都不利于綠色木霉進(jìn)行自絮凝，所成膠塊松散不完整，因?yàn)榫G色木霉在發(fā)生網(wǎng)結(jié)現(xiàn)象時(shí)[4]，自身會(huì)分泌物質(zhì)增強(qiáng)綠色木霉粘連，pH過(guò)低或過(guò)高可能會(huì)對(duì)這種物質(zhì)的合成產(chǎn)生抑制作用。因?yàn)榫G色木霉是在PDA液體表面進(jìn)行自絮凝的，越往上，三角瓶直徑越小，所以酶活越低。葡萄糖作為碳源是微生物可以直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，葡萄糖對(duì)綠色木霉自絮凝有一定的影響但影響不大。通過(guò)方差分析，當(dāng)顯著水平a=10%時(shí)，蛋白胨對(duì)自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)酶具有顯著性影響。蛋白胨主要提供氨基酸。真菌能夠分解自然界中的蛋白質(zhì)變成可被吸收的氨基酸，真菌利用蛋白質(zhì)能力是依賴(lài)其分泌蛋白酶分解大分子為較小基質(zhì)的能力。因?yàn)榫G色木霉菌絲之間需要聚集成膠從而才能分泌大量降解蛋白質(zhì)的酶，所以少量的蛋白胨對(duì)綠色木霉自絮凝具有促進(jìn)作用。但當(dāng)?shù)鞍纂诉^(guò)多時(shí)，具有底物反饋抑制作用，在一定程度上抑制了綠色木霉自絮凝。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉能進(jìn)行自絮凝固定化，且經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，酶活性到達(dá)較高的水平，用自絮凝法固定化綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] David,NS Hou.Polymer[J].New,1998,1(13):134-140

[2]王建榮,張曼夫,黃濤.綠色木霉纖維素酶CBHII基因的結(jié)構(gòu)研究[J].遺傳學(xué)報(bào),1995,22(1):74-80

[3]肖美燕,徐爾尼,陳志文.包埋法固定化細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(4):158-161

[4]朱啟忠.生物固定化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2009: 1-10

[5]劉穎,高晗,范婷婷.海藻酸鈉包埋法固定化綠色木霉的研究[J].食品科學(xué),2007,28(12):319-322

[6]劉穎,張瑋瑋,王馥.綠色木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,203(3):128-130

[7]趙凱,許鵬舉.3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J].食品科學(xué),2008,29(8):534-536

[8]代志凱,張翠,阮征.試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2010,37(6):894-903

[9]高鶴永,弓愛(ài)君,曲冬梅,等.正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化Bt發(fā)酵培養(yǎng)基[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2004,3(5):11-12

Study on the Conditions of Trichoderma Viride Immobilized with Self-flocculation

XING Huan1，XU Wen-zong1，LI Jie1，XU Yang-cang1，2，*
（1.College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin 300457，China）

Abstract：Researching on the conditions of Trichoderma viride immobilized with self-flocculation，so we could get high cellulase activity.First，we measured the effects of time，volume，pH，glucose and peptone concentrations on cellulase activity of self-flocculating immobilized Trichoderma viride.Then we used the orthogonal test design to obtain optimized combinations.The times，volumes and pH had a bell shaped curve effect on cellulase activity of immobilized Trichoderma viride with self-flocculating.The glucoses had small effect on cellulase ac

tivity，but the peptone had great effect on cellulase activity.The best optimal conditions of self-flocculation of immobilized Trichoderma viride were 6 d of time，70 mL of volume，6 of pH，2.25 % of glucoses and 1.50 % of peptones.Under the optimized conditions，the cellulase activity could reach 3.55 U after Trichoderma viride for cultivating of 72 h.

Key words：self-flocculating；orthogonal test；Trichoderma viride；cellulase

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.031

基金項(xiàng)目：教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金（第44批）；天津市科技興海項(xiàng)目（KJXH2012-14）

作者簡(jiǎn)介：邢歡（1989—），男（漢），研究生，研究方向：生物工程。

收稿日期：2014-11-27