高原紅細胞增多癥大鼠骨髓CD71+細胞EpoR表達、分布變化及意義

劉芳,馮婷婷，冀林華，韓園芳，丁謹

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海810000，2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

高原紅細胞增多癥大鼠骨髓CD71+細胞EpoR表達、分布變化及意義

劉芳1,馮婷婷2，冀林華2，韓園芳2，丁謹1

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海810000，2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察高原紅細胞增多癥(HAPC)大鼠骨髓CD71+細胞促紅細胞生成素受體(EpoR)表達及分布變化，并探討其意義。方法 將48只雄性SD大鼠隨機分為HAPC組和對照組，每組24只。HAPC組和對照組分別在海拔4 300、2 250 m自然環(huán)境下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)40天行血液學(xué)參數(shù)[RBC、Hb、紅細胞壓積(HCT)、動脈血氧飽和度(SaO2)]和骨髓細胞分類計數(shù)檢測，HAPC組RBC、Hb、HCT及紅系細胞數(shù)量、中幼紅細胞數(shù)量、晚幼紅細胞數(shù)量均高于對照組，SaO2低于對照組(P均<0.05)，證實HAPC模型制備成功。兩組均采用密度梯度離心法制備骨髓單個核細胞(MNC)懸液，CCK8法檢測MNC增殖能力(以O(shè)D450表示)，單層半固體培養(yǎng)法檢測紅系集落形成單位(CFU-E)數(shù)量。采用免疫磁珠分選法從兩組MNC懸液中分選CD71+細胞，免疫熒光法觀察細胞膜表面EpoR熒光情況，ELISA法檢測細胞膜和細胞質(zhì)EpoR表達，Real-time PCR法和Western blotting法檢測EpoR mRNA和蛋白相對表達量。結(jié)果 HAPC組和對照組OD450分別為1.54±0.04、1.17±0.05，CFU-E數(shù)量分別為(61.25±6.84)、(12.90±4.39)個；兩組比較P均<0.01。免疫熒光顯微鏡下可見兩組細胞膜表面均有環(huán)形或半環(huán)形的綠色熒光，但HAPC組細胞膜表面EpoR熒光強度和表達EpoR熒光的細胞數(shù)量均高于對照組。HAPC組及對照組CD71+細胞膜EpoR表達分別為2.41±0.03、1.55±0.06(P<0.05)；細胞質(zhì)EpoR表達分別為96.39±0.42、94.49±0.65(P>0.05)。HAPC組CD71+細胞EpoR mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 HAPC大鼠骨髓CD71+細胞EpoR表達升高，分布多集中于細胞膜表面；上述變化可能通過促進MNC及骨髓紅系細胞增殖而參與HAPC的發(fā)生、發(fā)展。

高原紅細胞增多癥；CD71+細胞；促紅細胞生成素受體；大鼠

高原紅細胞增多癥(HAPC)是一種常見的慢性高原疾病，以紅細胞過度積累、嚴重低氧血癥為特征，常并發(fā)心腦血管意外等多種致死率較高的嚴重疾病,其發(fā)病機制迄今仍未能闡明[1]。促紅細胞生成素受體(EpoR)是紅細胞發(fā)育過程中最有效且最主要的調(diào)節(jié)激素受體[2]。研究表明，缺氧是刺激機體產(chǎn)生EpoR的重要因子，可上調(diào)EpoR在組織中的表達[3]。EpoR高表達于紅系集落形成單位(CFU-E)至原紅細胞各階段的紅系細胞膜表面，通過與配體Epo結(jié)合活化JAK/STAT等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進血紅蛋白合成，使CFU-E向成熟紅細胞增殖分化[4]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)是表達于紅系祖細胞至網(wǎng)織紅細胞各分化階段的紅系特異性標志物之一[5]。2015年1～12月，本研究觀察了HAPC大鼠骨髓CD71+細胞EpoR的表達與分布，旨在為闡釋HAPC的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠48只，健康SPF級，2月齡,體質(zhì)量(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(陜)2012-003，合格證號61001700000509。試劑及儀器：大鼠骨髓單個核細胞分離試劑盒購自中國TBD公司，兔抗大鼠EpoR多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG-FITC購自美國Santa Cruz公司，HRP標記的二抗IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。TRIzol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas公司，SYBR Green PCR Master Mix購自美國Bio-Rad公司。

1.2 HAPC模型建立 將48只雄性SD大鼠隨機分為HAPC組和對照組，每組24只。參照文獻[6]方法，HAPC組自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部運至海拔4 300 m的青海省玉樹州珍琴鄉(xiāng)飼養(yǎng)，對照組在海拔2 250 m的西寧飼養(yǎng)。飼養(yǎng)40 天兩組均經(jīng)尾靜脈采血，采用全自動生化分析儀檢測RBC、Hb、紅細胞壓積(HCT)；經(jīng)頸動脈插管取血行動脈血氣分析，檢測動脈血氧飽和度(SaO2)；取股骨骨髓涂片后進行細胞分類計數(shù)，記錄每一視野下200個細胞中粒系細胞、紅系細胞及紅系細胞分類的數(shù)量，計算粒紅比，結(jié)果見表1～3。參照2004年第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會制訂的慢性高原病青海診斷標準[7]證實HAPC組模型制備成功。

表1 兩組血液學(xué)參數(shù)比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 兩組粒系細胞、紅系細胞數(shù)量及粒紅比比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

注：與對照組比較，*P<0.05。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 骨髓單個核細胞(MNC)增殖活性 采用CCK-8法。兩組均采用密度梯度離心法[8]制備MNC懸液。接種于含20% FBS、20 ng/μL IL-3、3 μmol/mL Epo的IMDM培養(yǎng)體系中，接種細胞密度為1×105/mL。HAPC組置于37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的飽和濕度低氧培養(yǎng)箱中，對照組置于37 ℃、5% CO2飽和濕度常氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，以O(shè)D450表示MNC增殖活性，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.2 紅系細胞增殖活性 采用單層半固體培養(yǎng)法。將兩組MNC密度調(diào)整為5×104/mL，接種于含20% FBS、20 ng/μL IL-3、3 μmol/mL Epo的甲基纖維素培養(yǎng)基。HAPC組置于37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的飽和濕度低氧培養(yǎng)箱中，對照組置于37 ℃、5% CO2飽和濕度常氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3天。倒置顯微鏡下觀察，以大于8個細胞的集落計為1個CFU-E，以CFU-E數(shù)量表示紅系細胞增殖活性。

1.4 骨髓CD71+細胞EpoR分布

1.4.1 細胞膜EpoR表達 ①采用免疫熒光法檢測：參照上法分離MNC，采用PE-CD71、Anti-PE MicroBeads相結(jié)合的免疫磁珠間接分選法分選兩組骨髓CD71+細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。滴片后采用4%多聚甲醛固定10 min。加入一抗EpoR(1∶50)，室溫1 h后4 ℃過夜；加入二抗IgG-FITC (1∶200)，37 ℃孵育1 h，加入DAPI 37 ℃孵育15 min。封片，熒光顯微鏡下觀察細胞膜表面EpoR熒光情況。②采用ELISA法[9]檢測：參照上法分選兩組CD71+細胞，4%多聚甲醛固定15 min，正常羊血清封閉30 min。加入一抗EpoR(1∶250)，4 ℃過夜；加入HRP標記的IgG(1∶80 000)37 ℃孵育1 h，TMB顯色劑室溫顯色10 min，終止反應(yīng)，測定OD450，ddH2O洗板。0.08%結(jié)晶紫室溫孵育20 min，33%冰醋酸室溫孵育30 min，測定OD550。細胞膜EpoR表達以O(shè)D450/OD550表示，每組設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照孔和陰性對照孔，實驗重復(fù)3次。

1.4.2 細胞質(zhì)EpoR表達 采用ELISA法。參照上法分選兩組CD71+細胞，采用反復(fù)凍融法提取細胞質(zhì)蛋白，依照Rat Erythropoietin receptor(EpoR)ELISA Kit說明書檢測細胞質(zhì)EpoR表達。每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 骨髓CD71+細胞EpoR mRNA及其蛋白相對表達量檢測

1.5.1 EpoR mRNA相對表達量 采用Real-time PCR法。參照試劑盒說明書提取兩組CD71+細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。EpoR上游引物：5′-CCGGGATGGGCTTCAACTAC-3′，下游引物：5′-TCCAGTGGCACAAAACTCGAC-3′，引物長度：101 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3′，引物長度：144 bp。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計算骨髓CD71+細胞EpoR mRNA相對表達量。

1.5.2 EpoR蛋白相對表達量 采用Western blotting法。參照試劑盒說明書采用RIPA裂解液提取兩組CD71+細胞總蛋白，BCA法定量后進行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗EpoR(1∶350)4 ℃過夜，加入二抗(1∶80 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光壓片顯色。以β-actin為內(nèi)參，以目的條帶吸光度與β-actin條帶吸光度的比值計算目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組MNC及骨髓紅系細胞增殖活性比較 HAPC組和對照組OD450分別為1.54±0.035、1.17±0.05，CFU-E數(shù)量分別為(61.25±6.84)、(12.90±4.39)個；兩組比較P均<0.01。

2.2 兩組骨髓CD71+細胞EpoR分布比較 免疫熒光顯微鏡下可見兩組細胞膜表面均有環(huán)形或半環(huán)形的綠色熒光，但HAPC組細胞膜表面EpoR熒光強度和表達EpoR熒光的細胞數(shù)量均高于對照組。HAPC組細胞膜EpoR表達為2.41±0.03，對照組為1.55±0.06；兩組比較P<0.05。HAPC組細胞質(zhì)EpoR表達為96.39±0.42，對照組為94.49±0.65，兩組比較P>0.05。

2.3 兩組骨髓CD71+細胞EpoR相對表達量比較 HAPC組和對照組骨髓CD71+細胞EpoR mRNA相對表達量分別為8.27±0.15、6.93±0.21，EpoR蛋白相對表達量分別為1.73±0.12、1.09±0.11；兩組比較P均<0.05。

3 討論

EpoR是無酪氨酸激酶活性的細胞因子受體超家族的一員，在正常紅系細胞表面表達極低，且很少能在細胞膜上循環(huán)利用[10,11]。EpoR主要表達于CFU-E形成階段，并隨著RBC的成熟而表達降低，網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞表面缺乏EpoR。研究證實，EpoR基因表達失調(diào)可引起紅系細胞生成障礙[12]。EpoR與其配體Epo結(jié)合形成同源二聚體后，激活與受體相連的Janus激酶(JAK2)，啟動JAK2/STAT5、JAK2/PI3K、JAK2/ERKs、NF-κB、JAK2/Ras/MAPK等多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化多種紅系細胞特異性因子，促進CFU-E增殖分化并抑制其凋亡，及時擴充正常成熟RBC數(shù)量以確保組織氧供[13]。有研究對懷孕18天的大鼠進行短暫低氧暴露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元EpoR表達增加[14]。Spandou等[15]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)缺血缺氧24 h大鼠腦組織中EpoR mRNA表達量顯著增高。Theus等[16]發(fā)現(xiàn)，缺氧的胚胎鼠腦神經(jīng)原中EpoR表達量可升高10倍。Beleslin-Cokic等[17]發(fā)現(xiàn)，低氧可以刺激內(nèi)皮細胞EpoR表達。以上研究均提示EpoR的表達是受低氧誘導(dǎo)的，因此推測高原缺氧環(huán)境可能對EpoR的表達有影響。

既往對HAPC的發(fā)病機制從多層面進行了研究，認為低氧刺激Epo分泌增多是高原RBC過度增殖的內(nèi)在分子機制[18]。但患者在高原環(huán)境停留一段時間后Epo可不再升高或出現(xiàn)下降，而RBC數(shù)量卻持續(xù)升高，甚至部分HAPC患者Epo水平接近于同海拔的健康人，說明Epo并不是高原低氧條件下RBC數(shù)量持續(xù)增高的惟一原因。吳洲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高原缺氧大鼠骨髓細胞EpoR的親和力表現(xiàn)為一過性升高，其數(shù)量在整個缺氧過程中呈現(xiàn)顯著升高的趨勢。因此，EpoR在高原低氧刺激RBC過度增殖過程中的作用不容忽視。

本研究結(jié)果顯示，HAPC組OD450明顯高于對照組，同時CFU-E數(shù)量顯著升高，提示高原低氧誘導(dǎo)下HAPC組MNC及骨髓紅系細胞的增殖能力增強。EpoR分布結(jié)果顯示，HAPC組骨髓CD71+細胞膜EpoR表達高于對照組，但兩組細胞質(zhì)中的表達無明顯差異，提示高原低氧條件下骨髓CD71+細胞EpoR表達主要集中于細胞膜。分析原因，可能是EpoR蛋白表達總量增高，進而促使細胞質(zhì)EpoR向細胞膜表面遷移，這樣可加強紅系細胞對Epo的反應(yīng)性，有利于啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達到擴充成熟RBC的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，HAPC組骨髓CD71+細胞EpoR mRNA及蛋白表達均明顯高于對照組。提示高原低氧誘發(fā)EpoR表達，使EpoR在細胞膜表面的表達升高，產(chǎn)生對Epo敏感性增強的異常效應(yīng)，從而促進MNC的過度增殖分化，參與HAPC的發(fā)生、發(fā)展。但是高原低氧環(huán)境上調(diào)EpoR表達的機制尚不明了，需進一步探討。

綜上所述，HAPC大鼠骨髓CD71+細胞EpoR表達升高，其分布多集中于細胞膜表面，這種表達及分布變化可能造成機體對Epo的異常敏感，進而引發(fā)相關(guān)信號通路的瀑布式激活過程，促進MNC及骨髓紅系細胞的增殖，從而參與HAPC的發(fā)生、發(fā)展。

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Changes of expression and distribution of EpoR in myeloid CD71+cells of rats with high altitude polycythemia

LIUFang1,FENGTingting,JILinhua,HANYuanfang,DINGJin

(1MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Qinghai810000,China)

Objective To observe the changes of expression and distribution of EpoR in myeloid CD71+cells of rats with high altitude polycythemia (HAPC) and to investigate the significance. Methods Forty-eight male SD rats were randomly divided into the HAPC group and control group, with 24 rats in each group. Rats in the HAPC group and control group were fed for 40 days under natural environment at altitude of 4300 meters and 2250 meters respectively and verified by hematology parameters [RBC, Hb, hematocrit (HCT), arterial oxygen saturation (SaO2)]detection and bone marrow cells counts. RBC, Hb, HCT, erythrocytic proportion, polychromatic erythroblast proportion and orthochromatic proportion of the HAPC group were higher than those of the control group, SaO2was lower than the control group (allP<0.05), which indicated that the establishment of rat model with HAPC was successful. We used the density gradient centrifugation to prepare the bone marrow mononuclear cell (MNC) suspension in both groups. The proliferation of MNC in the two groups was detected by CCK8 (manifested by OD450) and the colony formation of Colony Forming Unit-erythroid (CFU-E) was detected by ingle layer semisolid culture method. Myeloid CD71+cells were separated from MNC in the two groups by magnetic activated cell sorting method. Then EpoR fluorescence on the membrane surface of the two groups was observed by immunofluorescence assay. EpoR expression of cell membrane and cytoplasm was measured by ELISA. The relative expression of EpoR mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blotting. Results The OD450of HAPC group and control group were 1.54±0.035 and 1.17±0.05, respectively; the CFU-E colony formation of the two groups were 61.25±6.84 and 12.90±4.39, respectively (allP<0.01). The immunofluorescence results showed that a ring or semi-annular green fluorescence appeared on the surface of cell membrane in the two groups. However, the fluorescence intensity of EpoR on cell surface and the number of cells expressing EpoR fluorescence of the HAPC group were higher than thsoe of the control group. EpoR expression in cell membrane of the HAPC group and control group was 2.41±0.03 and 1.55±0.06, respectively (P<0.05). EpoR expression of cytoplasm in the HAPC group and control group was 96.39±0.42 and 94.49±0.65, respectively (P>0.05). The relative expression of EpoR mRNA and protein in myeloid CD71+cells of HAPC group was higher than that in the control group (allP<0.05). Conclusion The expression of EpoR in myeloid CD71+cells of HAPC rats is increased and its distribution is concentrated on the surface of the cell membrane, which might be related to the occurrence and development of HAPC by promoting the proliferation of MNC and erythroid cells.

high altitude polycythemia; CD71+cells; erythropoietin receptor; rats

國家自然科學(xué)基金資助項目(81441116)；青海省科技廳(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計劃項目(2012-Z-729)；青海大學(xué)“123高層次人才培養(yǎng)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人基金項目；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金團隊項目(2014-KT-1)。

劉芳(1972-)，女，教授，研究方向為慢性高原病的發(fā)病機制。E-mail： qhxnlf2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.005

R555.1

A

1002-266X(2016)32-0015-04

2016-01-26)